2023 Fiscal Year Annual Research Report
Structural profiling of fungal cell wall polysaccharides using functionally modified glycoside hydrolase
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23H02720
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
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Principal Investigator |
山中 大輔 東京薬科大学, 薬学部, 講師 (70734599)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
木村 将大 東京工科大学, 応用生物学部, 助教 (80910215)
安達 禎之 東京薬科大学, 薬学部, 教授 (60222634)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2027-03-31
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| Keywords | 真菌 / 細胞壁 / 多糖 / 糖質加水分解酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題は、糖質加水分解酵素を利用して真菌細胞壁を構成する様々な多糖類に対する特異的結合タンパク質の創出を目指すものである。2023年度には、多くの病原性真菌の細胞壁に共通して存在するβ-1,3-グルカンを特異的かつ高感度に検出する目的で、糖質加水分解酵素の改変体を設計し、大腸菌を用いて発現させた。様々な酵素に由来する改変体の機能を評価し、真菌由来β-1,3-グルカンに対し強い結合を示す候補を選出した。得られた一部の候補タンパク質を、各種機能性ペプチドタグと融合し、β-1,3-グルカン存在下でのみ発光を示すホモジニアス測定法を構築した。最も結合活性の高い改変型酵素を用いた測定法では、pg/mLレベルのβ-グルカン定量が可能となり、カンジダ菌の培養上清からもβ-1,3-グルカンシグナルを検出することに成功した。また、特定の病原性真菌細胞壁に存在するα-1,3-グルカンに対する特異的結合タンパク質を獲得するために、複数の糖質加水分解酵素の改変体を設計し、大腸菌で発現させた。一部の改変体が真菌α-1,3-グルカンに対する結合を示したため、そのうち最も強い結合活性を持つ改変体の機能を詳細に解析し、この改変体がα-1,3-グルカン以外の真菌多糖とは結合しないことを確認した。この候補タンパク質に、各種機能性ペプチドタグを融合することで、α-1,3-グルカン特異的な検出法を構築するに至った。いずれの候補タンパク質も標的多糖に対する結合特異性が高いため、真菌の病原性を左右する細胞壁多糖の構造解析に適したタンパク質プローブとしての応用が期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
タンパク質の発現工程及び機能解析のプロトコルをさらに効率化し、発現から精製、簡易解析を終えるまでの期間を大幅に短縮した。設計した多くの酵素改変体はグルカンとの強い結合活性を示さなかったが、得られた一部の候補タンパク質を応用することで、2種類のグルカン構造を特異的に検出する手法を開発するに至った。一方、その他の多糖構造に対する結合タンパク質の開発にも着手しており、多数の酵素改変体の発現・機能評価を進めている。従って、本研究課題はおおむね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
引き続き、糖質加水分解酵素をもとに、真菌多糖に特異的に結合するタンパク質プローブの開発を進める。また、2023年度に得られた各種グルカン結合タンパク質候補の結合活性を向上させる検討を進め、検出感度の向上を試みる。
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