2023 Fiscal Year Annual Research Report
Elucidation of novel onset mechanisms of pediatric neurological disorders focusing on non-coding regions of the genome
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23H02875
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Hamamatsu University School of Medicine |
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Principal Investigator |
才津 浩智 浜松医科大学, 医学部, 教授 (40402838)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | 非コード領域 / インフォマティクス解析 / スプライス異常 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
（1）インフォマティクス解析による非コード領域に存在する変異の病的意義予測：エクソーム解析で原因未同定例の23例において全ゲノム解析を施行し、通常の点変異に加えて、コピー数変異、ゲノム構造異常、トランスポゾン挿入、ヘテロ接合性の消失領域、リピート配列伸長の検出を行った。その結果、3例において染色体微細欠失が同定され、更に切断点配列を決定した。その結果、切断点特異的PCRが可能になり、ご両親のモザイク欠失の有無についても高感度で検査することができた。
（2）新しい実験系による候補変異の機能解析：非コード領域の変異の病的意義を評価するために、28例において非侵襲的に採取可能な尿中の上皮細胞（尿細胞）を培養し、RNA-seq解析を行ってスプライス異常等の発現異常を評価した。その結果、1例において2つの遺伝子のプロモーターを含むホモ接合性欠失による発現消失が同定できた。更に、尿細胞のRNA-seqでイントロン2に異常なリードが認められたが、ショートリードの全ゲノムでは異常が同定できなかった症例に対して、ナノポアシークエンサーを用いたAdaptive samplingを行い、約3-kbのトランスポゾンの挿入を同定した。更に、挿入配列を加えた新たな参照ゲノム配列を作成し、RNA-seqデータを再解析したところ、挿入からエクソン3にスプライスしているリードを16リード認め、挿入によってスプライス異常が起こっていることを明らかにできた。また、尿細胞や末梢血単核球細胞で発現していない遺伝子に関して、ミニジーンスプライシング解析を1例で施行し、エクソンの最後の塩基置換でエクソンスキップを起こすことを証明することができた。また、CDH2遺伝子のde novo変異（c.1344+5G>A）を導入したファウンダーマウスは作成でき、現在交配によって増やしており、来年度に解析予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
全ゲノム解析と尿細胞を用いたRNA-seq解析、およびロングリードシークエンスを駆使した解析を行うことで十分な研究成果を得ている。ミニジーンスプライシング解析結果をまとめた論文を執筆中である。また、CDH2変異ノックインマウスもファウンダーマウスが得られており、さらに、5-UTRのバリアントも見つかっている。これらの結果が得られており、研究は順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
尿細胞を用いたRNA-seq解析が成果を挙げているので重点的に推進する。全ゲノム解析に関しては、適宜ロングリードシークエンスも取り入れて新規疾患発症メカニズムの解明に挑む。さらに、5-UTRのバリアントも見つかっており、そのバリアントの病的意義を証明するために、発現ベクターを作成して翻訳高率に与える影響を評価する。
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Research Products
(19 results)
