2023 Fiscal Year Annual Research Report
Drug discovery research targeting the lysosomal nutrient sensing mechanism for the prevention of NASH-related liver cancer
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23H02898
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
田中 靖人 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 教授 (90336694)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
馬場 理也 熊本大学, 国際先端医学研究機構, 准教授 (10347304)
佐藤 悠介 北海道大学, 薬学研究院, 助教 (10735624)
田中 義正 長崎大学, 先端創薬イノベーションセンター, 教授 (90280700)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | 非アルコール性脂肪性肝炎（NASH） / オートファジー / ライソゾーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
コリン欠乏高脂肪食によるNASH肝癌モデルにおいて、FLCN-KO （マウス）により、NASHや肝発癌が抑制されることが証明された。NASH肝癌はmTOR pathwayと深い関わりがあることが示唆されており、FLCN抑制によるmTOR経路への影響を明らかにする。さらに、FLCN-FNIP1及びFLCN-FNIP2の蛋白質間相互作用機構を明らかにするため、分子動力学シミュレーション(MDシミュレーション)を行った結果、ヘリックス2とBの間にFLCN-FNIPの結合を阻害する分子が入り込む余地があると考えられた。MDシミュレーションで明らかにしたFLCN-FNIP1/2相互作用に重要な部位を標的としてインシリコスクリーニングを開始した。
本研究では、新たにFLCNを標的としたin vivoゲノム編集DDS製剤を開発し、NASH及びNASH肝がんの発症・進展の新規病態機序の解明及び治療効果を検証する。FLCN-FNIP複合体の分子動力学シミュレーション、オリジナル化合物による独自の創薬システム、安全で高効率なドラッグデリバリーシステムを組合せるとともに、ライソゾーム栄養感知機構を標的とした新規治療薬の開発を進める。本研究は栄養感知メカニズムを軸にした包括的かつ独創性の高い研究であり、NASH患者の予後改善に繋がる新たな治療法の開発が期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１）FLCN-KO マウスの作成とコリン欠乏高脂肪食投与実験 Alb-Cre(+) FLCN F/FのマウスとFLCN F/Fのマウスを交配にかけて、Alb-Cre(+)/Alb-Cre(-) FLCN F/Fの雄マウスを獲得した。Alb-Cre(+) FLCN F/FとAlb-Cre(-) FLCN F/Fのマウスを分けて、2種のGenotypeのマウスにそれぞれコリン欠乏高脂肪食(CDHFD)と普通食を投与する２グループに分け、合計４グループをキープした。約40週で剖検した結果、CDHFDを投与したマウスの中に、FLCN-WTの方は明らかに肝癌が多発し、NASHの存在も確認された。一方、FLCN-KOの方では、脂肪滴はあるが線維化はなく、肝癌もほとんど確認できなかった。
２）FLCN-KO マウスにおける遺伝子発現解析 RNA seq解析の結果、NASH肝癌はmTOR pathwayと深い関わりがあることが示唆された。現在メカニズム解析中である。
３）FLCN-FNIP複合体の分子動力学シミュレーションとドラッグスクリーニング FLCN-FNIP1及びFLCN-FNIP2の蛋白質間相互作用機構を明らかにするため、分子動力学シミュレーション(MDシミュレーション)を行った結果、ヘリックス2とBの間にFLCN-FNIPの結合を阻害する分子が入り込む余地があると考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
1) NASH肝がんモデルマウスのさらなる解析を進め、病態の進行による変化をFlcn-KOマウスとコントロールマウス間で比較解析する。特に、2023年度に実施したRNAseqにより得られた、病態解明に重要な候補分子やオートファジー関連分子を、肝臓構成細胞（肝細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞、星細胞、クッパ―細胞、各種免疫担当細胞等）のマーカー分子と共に解析する。
2) 肝細胞特異的Flcn-KOマウス及びNASH肝がんモデルマウス(hTLL1-TGマウス)における肝特異的Flcn KOの解析：① 組織学的解析（HE染色、脂肪含有量、特殊染色による線維化の定量、アポトーシス、細胞死の定量、前がん病変・腫瘍の定量）。② 免疫染色（LAMP1, LC-3, p62, TFE3, TFEB）によるオートファジー・ライソゾーム経路や炎症（免疫細胞浸潤）、線維化反応(星細胞、myofibroblast)、細胞増殖（ki67, リン酸化HistoneH3）を評価・解析する。
3) 上記モデルマウスの解析結果に基づいて、ヒト臨床検体のNASH肝及びNASH肝がんを評価する。
4) FLCN-FNIP複合体のインシリコドラッグスクリーニング：スーパーコンピューターTSUBAMEによるインシリコドラッグスクリーニングを検討する。特に、MDシミュレーションで明らかにしたFLCN-FNIP1/2相互作用に重要な部位を標的としてインシリコスクリーニングを行う。
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