2023 Fiscal Year Annual Research Report
小型魚類胚動物代替生体毒性評価法によるAOPの構築と活用
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23H03562
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | Ariake National College of Technology |
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Principal Investigator |
冨永 伸明 有明工業高等専門学校, 創造工学科, 教授 (30227631)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平野 将司 東海大学, 農学部, 特任准教授 (20554471)
甲斐 穂高 鈴鹿工業高等専門学校, 生物応用化学科, 准教授 (50518321)
内田 雅也 有明工業高等専門学校, 創造工学科, 准教授 (80575267)
石橋 弘志 愛媛大学, 農学研究科, 准教授 (90403857)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2027-03-31
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| Keywords | メダカ胚 / 動物代替試験 / AOP / 生体毒性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
エストロゲン様作用をAOとして，本課題で用いる評価方法と従来法を比較し，有効性を明確にした．エストラジオール（E2）を用い，オスの性転換をAOとして比較した．0.1uM E2暴露でほぼ100％メス化したことから，浸漬法の報告と比較し，約1/30の濃度および1/12の暴露時間で同様のAOが検出可能であり，高感度であることが分かった．また，メダカ胚における核内受容体ER分子種の発現状況を調査したところ，6から８dpfにERbetaの発現が有意に上昇することが分かった．0dpf でのE2暴露では数倍にしか上昇しなかったコリオゲニンL,Hの発現が6および8dpfの卵にE2暴露では2日後でそれぞれ約5倍，10倍以上の著しく増加することが確認できた．受容体の発現に合わせたウインドウを選択することで，AOが強く現れた．このことは，KEとなる受容体との結合に伴ったエンドポイントを用いた評価を行う場合，暴露するウインドウの選択が重要であり，本法を用いることで容易に高感度検出が可能であることが分かった．
一般的な毒性におけるKEと考えられるCypsの誘導をNSAIDsであるインドメタシン，イブプロフェン暴露によりQPCRで網羅的に検討したところ，成魚ほどではなかったが， CYP 1A, 3a40-1, 3a40-2, 2J2-2の発現誘導を検出することができた．また，sod1, catの発現上昇も確認できたことから，有用な指標にできると考えられる．
神経発生毒性についても検討した．0dpfでイミダクロプリド暴露後，孵化した個体において神経形成に異常が見られるものがあったが，検討個体数が少ないため，神経発生毒性を有するかは断定できなかった．今後，個体数を増やす必要があると考えられる．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究課題で用いる高電界エレクトロポレーションによる物質導入は，従来法に比べ，高感度であることを確認できた．また，エストロゲン様作用の評価における暴露ウインドウについても明らかにできた．数種のCypsサブタイプの発現上昇が一般毒性のKEとして本評価系で測定可能であることも分かった．神経細胞の染色については，良好な蛍光免疫染色観察結果が得られたが，神経発生毒性が明確な物質を用いる必要があった．今年度の目標とした計画は，ほぼ達成できたと考える．
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| Strategy for Future Research Activity |
エストロゲン様作用について，核内レセプターの発現と応答遺伝子の発現上昇を指標に適切な暴露ステージを決定できたことから，膜結合性受容体のアゴニスト．アンタゴニストを用いて，膜結合性受容体がエストロゲン様作用のメス化というAOおよびビテロジェニン，コリオジェニンの誘導というKEへの関与について検討し，膜結合性受容体によるAOについて確認する．また，NSAIDs以外の一般毒性化合物を用いてCyps等の発現誘導を検討してKEとしての有効性を確認する．神経発生毒性は影響が明確な物質による神経発生毒性の蛍光抗体染色画像を作製し，神経系に対する影響のAOのモデルとする．
in sillicoによる核内受容体のモデル構築と対象化学物質のドッキングシミュレーションを行い，胚発生毒性AOとの相関性の検討を進めていく．
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