2023 Fiscal Year Annual Research Report
Understanding the diverse regulatory mechanisms of IL-1beta release in inflammatory responses using live-cell imaging of secretion activity
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23H03708
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| Allocation Type | Single-year Grants |
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
白崎 善隆 東京大学, 先端科学技術研究センター, 准教授 (70469948)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
楊 倬皓 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 特任研究員 (00941650)
原田 慶恵 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (10202269)
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| Project Period (FY) |
2023-04-01 – 2026-03-31
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| Keywords | LCI-S / FluroroSpot / ライブセルイメージング / IL-1β / 細胞死 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
感染に対する生体の炎症反応において誘導の役割を果たすインターロイキン(IL)-1βの産生は、必ず炎症性細胞死に伴い放出されるのか、 それとも生きた細胞からも放出される機構があるのか、未だ議論に決着がついていない。本研究は、細胞死の最終実行因子である細胞膜開孔形 成分子群に着目し、様々な細胞、様々な炎症性細胞死において、膜開孔形成分子の欠損が、IL-1β放出を制御し得るか否かを、先進の細胞分泌 ライブセルイメージング技術によって明らかにする。
当該年度においては、研究代表・白崎が開発した導波路型全反射蛍光照明装置を基盤に分担・楊がリアルタイムFluoroSpotアッセイシステムおよび解析方法の確立を行った。特に、IL-1βの産生が生きた細胞に由来するか、死んだ細胞の膜破綻に由来するかを判別するにあたり、本研究では、IL-1βの分泌（放出）動態に着目することが有用と考えた。そこで、リアルタイムFluoroSpotアッセイで得られる捕捉した分泌因子の蓄積を反映する蛍光シグナルに対して、蛍光抗体染色ダイナミクスを加味して分泌因子の蓄積の増加を算出する数学的アルゴリズムを開発した。これにより、IL-1βの産生が過渡的であるか、それとも継続的であるかの判別を可能とした。
一方、分担・原田は、当該年度において上記のリアルタイムFluoroSpotアッセイシステムの導入を行った。さらに、研究協力者のドイツ国ケルン大学マノリス研究室・永田博士から、細胞死関連膜開孔分子遺伝子欠損マウスおよび野生型マウスの骨髄細胞の提供を受け、マクロファージおよび樹状細胞の分化プロトコールの確立および、各種細胞死（パイロトーシス、ネクロプトーシス、アポトーシス）誘導条件および誘導時のIL-1α、β放出の観察条件の確立を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度においては、当初の計画通りにライブFluoroSpotアッセイの開発が順調に行われた。また、分担機関への技術移転も計画通りに良好に進んでいる。協力研究機関からの生物試料の提供も計画通りに進んでおり、細胞材料の調整のプロトコル確立も順調である。
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| Strategy for Future Research Activity |
当該年度は、当初の計画に沿って順調に技術開発および研究が進められており、次年度においても、計画にそって研究を遂行する予定である。次年度においては、現時点において既知となっている細胞死関連膜開孔分子の遺伝子欠損に基づいて、各種細胞死誘導条件におけるIL-1βの放出動態の制御を検討する予定である。一方で、これまでの検討から、市販の抗IL-1β抗体セットは、成熟型IL-1βのみを検出する可能性が高くなった。そこで、次年度においては、１分子型標的検出プローブの開発を新規課題とし、１分子蛍光計測に造詣が深い分担者を追加する。さらに、確立したリアルタイムFluroSpotアッセイシステムの社会実装を念頭とした簡易型システムの開発にも着手する。
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[Presentation] Live fluorosopt: High-througput system for real-time single-cell secretion imaging with optical waveguide chip2023
Author(s)
Z. Yang, M. Yamagishi, N. Suzuki, Y. Kurisu, K. Nagaoka, K. Moro, K. Kakimi, E. Kuroda, S. Sakuma, T. Funatsu, Y. Shirasaki
Organizer
the International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences (μTAS 2023)
Int'l Joint Research
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