2023 Fiscal Year Research-status Report
新規in vivo非線形ラマン分光イメージング法の開発による睡眠制御機構の解明
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23KJ0267
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| Research Institution | University of Tsukuba |
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Principal Investigator |
村上 優介 筑波大学, グローバル教育院, 特別研究員(DC1)
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| Project Period (FY) |
2023-04-25 – 2026-03-31
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| Keywords | 非線形ラマン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
膜電位のラベルフリーイメージングおよび睡眠分子の探索を目指し、膜電位を操作しながらMultiplex CARSスペクトルを取得することが可能な装置を共同研究先に立ち上げ、生細胞とマウス脳スライスの測定を行なった。研究成果として、CARS顕微鏡下で膜電位を走査できる手法を確立し、膜電位毎によってCARSスペクトルに変化があることを発見した。また、Multiplex CARSとSHGによって、脳のラベルフリーイメージング法とMCR-ALS法による特徴的な分子組成の探索法を確立し、通常のマウス脳においても、複数の分子がラベルフリーで可視化できることを確認した。海馬や脳室においても、特徴的なSHGシグナルを発見した。これは、免疫染色法によって線毛根であることを同定した。multiplex CARSイメージングとの同時測定によって線毛根は海馬において特徴的な分布を示すことが明らかになり、線毛根の分子組成を示すCARSスペクトルも取得した。また、培養神経細胞においても、一次繊毛の発生前に線毛根が存在していることを確認した。これらはCARSによって膜電位の定量が可能になること、通常のマウスと断眠マウスを比較する上で重要な手法となることが考えられる。線毛根の可視化においては神経細胞における線毛根の存在は重要視されていなかったが、今回確立した可視化手法によって繊毛病やがんとの関連性の解明につながることが示唆される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
膜電位のラベルフリーイメージングを目指し、パッチクランプ法によって膜電位を操作しながらMultiplex CARSスペクトルを取得することが可能な装置を共同研究先に立ち上げた。精細胞を用い、MUltiplex CARS 顕微鏡下にてパッチクランプ法を行い、膜電位毎におけるCARSスペクトルを取得した。その結果CH領域と指紋領域において膜電位によって強度の変化が顕著なバンドを発見した。これは、培地のカリウムイオンの変化による膜電位の変化によっても同様に変化をしたため、膜電位由来であると結論づけた。
また、パッチクランプ法を行いながら CARSイメージングを行うためのイメージング系の検討を行った。通常のCARS顕微鏡はサンプルを走査することが多いがガラスピペットを細胞に差し込むとイメージングが困難となる。そのため、ガルバノミラーのペアを２組用意し、MUltiplex CARSのスキャンデスキャンイメージング装置を開発した。現在30マイクロメートル四方のイメージングに達成している。
さらに睡眠分子の探索を目指し、MUltiplex CARS/SHGのマウス脳イメージング法を確立した。CARSスペクトルにMCR法を導入することによってスペクトルをいくつかのコンポーネントに分けることが可能になり、分子の一斉探索が可能となった。
またSHGイメージングによって海馬や脳室の線毛根のイメージングが可能となった。健常のマウスでも線毛根は細胞内で特異的な分布を撮ることが明らかになった。
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| Strategy for Future Research Activity |
共同研究先の異動のため、再度装置の立ち上げが必要である。よりスキャンデスキャンイメージングに特化した装置の開発を行う。膜電位を変化させながらCARSイメージングを行い、膜電位の定量イメージング法を確立する。
マウスの脳に関しては今年度確立したイメージング法を断眠したマウスと比較し、睡眠分子の探索を行う。また、断眠したモデル以外にも、線毛根(中心体)の位置は繊毛病や癌などにも関連しているという先行文献がある為、その比較も行う。
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| Causes of Carryover |
論文の投稿費用として準備していたが、年度内に間に合わなかった。現在執筆中のため、次年度使用予定。
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Research Products
(8 results)
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[Journal Article] Backward multiplex coherent anti-Stokes Raman (CARS) spectroscopic imaging with electron-multiplying CCD (EM-CCD) camera2023
Author(s)
Yusuke Murakami, Minami Yoshimura, W. J. Niels Klement, Atsuki Oda, Ryo Sakamoto, Miho Yakabe, Atsushi Matsumoto, Ryosuke Oketani, Philippe Leproux, Junichi Ikenouchi, Wesley R. Browne, and Hideaki Kano
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Journal Title
Optics Continuum
Volume: 9
Pages: 2044-2054
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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