2023 Fiscal Year Research-status Report
Establishment of an in vitro culture system of Cryptocaryon irritans and development of its control method using circadian rhythms
| Project/Area Number |
23KJ0428
|
|---|
| Research Institution | The University of Tokyo |
|---|
Principal Investigator |
小竹 真帆 東京大学, 農学生命科学研究科, 特別研究員(DC2)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2023-04-25 – 2025-03-31
|
| Keywords | 海産白点虫 / 概日パターン / 光周期 / 光受容体 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
我々は海産白点虫（以下、白点虫）が持つセロント放出における概日リズムに着目し、研究を進めている。昨年度はまず白点虫のin vitro培養系で、二層培養法で用いるアガロースゲルに変わる素材としてヒアルロン酸を用いて培養実験を試みたものの、ヒアルロン酸水溶液は非常に粘性が高く、熱に対して不安定であるため滅菌が難しく、in vitro 培養系に用いることができなかった。
また、これまでの研究結果から、本虫のシストに12時間周期の明暗リズムを与えると新しい概日リズムを形成することが分かったため、短日条件を（明期6時間）与えた場合の概日リズムを調べた。すると、光が消えてからおよそ7時間後にシストからセロントが放出された。これはシストは短日条件下でも新しく概日リズムを形成できることを示唆している。
また、本年度の分子メカニズム解明に向けての基礎作りとして2株のゲノムシーケンスとトランスクリプトーム解析のデータを取得し、ゲノムの遺伝子予測までを行った。得られたデータをもとに、過去に当研究室で得られたトランスクリプトーム解析の結果から見つかった光受容体のアノテーションがついた遺伝子を探索したところ、相同性が95％を超えるものが見つかった。そこで、その遺伝子についてホモロジー検索およびドメイン検索をおこなったところ、フォトリアーゼファミリーのタンパク質でありFAD binding siteとデオキシピリミジンフォトリアーゼのドメインであるPhrBが保存されていることが示唆された。クリプトクロムはフォトリアーゼから進化したとされるタンパク質であり、動物では青色光受容体もしくは時計遺伝子として働くことが知られており、白点虫の光受容体として働く可能性がある。そこでCas9を用いて当該遺伝子をノックアウトし機能解析を試みたが、うまくいかなかった。本年度にはほかの方法での機能解析手法の確立も試みたい。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度は研究室で継代維持していた株が途絶えてしまい、急遽新たに株を確立させ、継代維持できる状態にしなければならなかったため、大量の虫体が必要となるin vitro培養系の改良は上記の通り不発に終わってしまった。しかしながら、新たに短日条件下で形成される概日リズムについて新たな知見が得られたほか、途絶えてしまった株と新しく確立した株の2株についてゲノム情報を取得し、かつ後者については当初の予定通りトランスクリプトーム解析も行うことができたほか、予想外に光受容体探索が進んだため「おおむね順調に進展している」と判断した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
in vitro培養系の改良にはまだ時間を要するため、先に基礎が固まっている概日リズム形成にかかわる分子メカニズムの解明について、トランスクリプトーム解析の結果をもとに概日リズム形成にかかわる遺伝子の探索を行う。上記の通り、Cas9を用いたノックアウト虫体の作製は困難であったが、過去の研究ではノックアウトに成功した事例もあるため、概日リズム形成にかかわる遺伝子をノックアウトした虫体の作製し、機能解析を試みる。光受容体の候補として青色光受容体であるクリプトクロムが挙がったため、ノックアウト虫体を作製し、機能解析を試みるほか、シストが青色光を受容するかについても調べる。
|
| Causes of Carryover |
当該年度で予算はおおよそ使い切ったものの、端数の63円が余ってしまい、この金額では追加物品等購入できなかったため次年度に使用することとした。こちらについては次年度の必要物品購入に使用する予定である。
|
