2023 Fiscal Year Research-status Report
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23KJ0852
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
長井 博紀 東京農工大学, 大学院連合農学研究科, 特別研究員(DC2)
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2023-04-25 – 2025-03-31
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| Keywords | ウシ胚 / 初期発生 / 部分的コンパクション / 自己修復 / Live-cell Imaging |
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| Outline of Annual Research Achievements |
私はこれまでの研究で、ウシ胚で染色体異常を有する細胞が部分的コンパクションによって排除される可能性を示している。同様の報告がヒトでもなされているがいずれの報告も“可能性が示された”段階であり、不確実性を孕んでいる。本研究は、ウシ胚で部分的コンパクションを介して排除される細胞の特徴を多角的な視点から明らかにすることで「部分的コンパクションを介した自己修復が起きる」という言説の正当性をより確実なものとし、また、自己修復メカニズムを解明することを目的としている。
mRNAのマイクロインジェクションと培養機能を備えた蛍光顕微鏡とを組み合わせたlive-cell Imagingにより、初期発生過程における、胚を構成する割球1個1個と、それらに含まれる染色体の挙動を観察した。排除される割球では微小核を形成したものや、細胞分裂失敗により多核を有するもの、あるいは無核のものが多く観察され、排除割球が残された割球と比べて異常を多く有することを観察ベースで明らかにした。
体外受精卵移植で課題となっている低受胎率の要因として染色体異常があり、これには減数分裂過程で生じるものと体細胞分裂過程で生じるものとがある。後者において、初期卵割時に染色体分離エラーによって生じた異常が後の発生にも引き継がれることで、異なる染色体ステータスを有する細胞で構成されるモザイク胚が形成されるというのが通説である。しかし、2023年度の成果から、通説とは異なり、初期卵割で生じたエラーは部分的コンパクションによって後の胚発生に引き継がれていないことが考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
初期発生過程において、コンパクションと呼ばれる現象があり、これを境に倍々に増えた細胞が一度一塊となり、胚は将来胎児となる内部細胞塊と将来胎盤を形成する栄養外胚葉とを形成する。私の過去の研究で、このコンパクション時に一部細胞が排除されることがウシ胚で明らかになっている。定説とは異なり、初期卵割で生じたエラーは部分的コンパクションによって後の胚発生に引き継がれず、排除された細胞は残された細胞よりも異常を多く抱えているという仮説を立て、研究を行った。
mRNAのマイクロインジェクションと培養機能を備えた蛍光顕微鏡とを組み合わせたライブセルイメージングにより、初期発生過程における、胚を構成する割球1個1個と、それらに含まれる染色体の挙動を観察した。排除される割球では微小核を形成したものや、細胞分裂失敗により多核を有するもの、あるいは無核のものが多く観察され、排除割球が残された割球と比べて異常を多く有することを観察ベースで明らかにした。
ライブセルイメージングを行った胚から異常を有したものと有していないもの、排除されたものと排除されなかったものとをそれぞれサンプリングし、シングルセルRNA-seqに供した。現在シーケンスデータを解析中である。
ライブセルイメージングで染色体の分離異常の有無と部分的コンパクションによる排除の有無を基に区分けをしてRNA-seqに供したが、異常が観察されながらも排除されない割球や異常が観察されないながらも排除された割球の出現頻度が低く、サンプリングに時間を要したため予定より進捗が遅れた。
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| Strategy for Future Research Activity |
ライブセルイメージングの結果、染色体の挙動に異常が観察されないながらも排除された割球が存在した。染色体に異常が生じることで排除されているという当初の考えからは外れた結果であり、排除する基準は染色体に異常があるかどうかではない可能性がある。一方であくまで観察ベースで異常がなかっただけであり、次世代シーケンスベースで調べれば異常を抱えていたかもしれない。そこで、RNA-seqの結果からコピー数の変化を捉えるinfercnvを行うとともに、改めて改めてサンプリングした割球をCNV-seqに供す。
RNA-seqデータ解析の結果、排除された割球ではRNAプロセッシングやRNAスプライシングのpathwayに関わる遺伝子が落ちた一方で、全体の発現変動としては上がっていた。このことから、本来スプライシングを受けて成熟することで生成されるmRNAが作られず、もとのRNAが残っているため全体としては発現があがったと考えている。junctionseqという手法によるスプライシング解析を外注することもできるが、DEXseqやrMATSを用いたスプライシングバリアント解析により、排除割球とコンパクションに関与した割球との間でスプライシングパターンの変化を自前でも調べられる。後者で進めることを第一候補に現在検討中である。
また、発現変動遺伝子のなかでめぼしいものがあれば、RNA干渉による遺伝子ノックダウンを利用して、部分的コンパクションの発生に変化が生じるかを観察したいと考えている。
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| Causes of Carryover |
令和５年度は物品費として580,000円、旅費300,000円、その他120,000円の計900,000円を予算として組みましたが、実支出としては物品費250,282円、旅費490,790円、その他157,926円の計898,998円であったため、1,002円の次年度使用額が生じました。
カナダのオタワで開催された繁殖生物学の学会に参加し、それにかかった渡航・宿泊費を旅費として計上しましたが、渡航費が予算より大きく、190,790円の超過となりました。また、その他に計上した学会参加費も予算より大きく、37,936円の超過となりました。それを受けて、物品費として計上する予定だった解析用PCおよびPC関連用品を、予定と異なる組み合わせにしたため、予算より329,718円低い支出となりました。
以上当初の予定からの変更により1,002円の次年度使用額が発生しています。
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