2012 Fiscal Year Annual Research Report
シアノバクテリアの時計タンパク質による概日時間の生成機構
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24000016
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| Research Category |
Grant-in-Aid for Specially Promoted Research
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
近藤 孝男 名古屋大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (10124223)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
秋山 修志 分子科学研究所, 大学共同利用機関等の部局等, 教授 (50391842)
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| Project Period (FY) |
2012-05-29 – 2017-03-31
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| Keywords | シアノバクテリア / 生物時計 / 概日リズム / 時間生物学 / 生物物理学 / Kai / 構造生物学 / 周期の温度補償性 |
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| Research Abstract |
本研究課題の目的は，シアノバクテリアのKaiタンパク質時計を題材に，概日時計の最も基本的な発振原理を解明し，さらには情報処理能力を備えたタンパク質ファミリーの存在や生物学的意義について検討することである．本年度は，次の４つの点について研究を展開した．
１）KaiCのATPase活性とリン酸化サイクルのメカニズム KaiCのATPase活性は，概日リズムの振動数と比例しかつ温度補償されているという事実からも極めて重要である．周期を決定するATPaseがkinase活性およびphosphatase活性とどのようにカップリングしているかを解明するため，各種変異体を用いた詳細な生化学的活性測定を行った．
２）KaiCの構造生物学的解析／生物物理的機能解析 構造解析に向けた準備として，Kaiタンパク質および各種変異体の調製方法を最適化した．また，整備された蛍光計測システムを用いてKaiCの概日揺らぎを計測し，KaiCの動的な構造変化をアミノ酸レベルでピンポイント計測した．さらに，酵素活性の制御工学的解析等を行った．
３）細胞内でのKaiCリン酸化サイクルの動態 KaiCリン酸化サイクルの同調がKaiAの相対濃度の変化によっておこる可能性を明らかにした．
４）真核生物のKaiCホモログの探索 KaiC様の情報処理機能を備えたタンパク質の候補としてATPase群を広範囲に１次スクリーニングし，幾つかの候補について,２次スクリーニングを行った．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成24年4月に研究分担者の秋山が分子科学研究所へ研究拠点を移し，構造生物学的研究／生物物理学的研究を推進する環境・研究体制を構築するのに一定の期間を要した. また研究代表者は２５年３月に定年退職し, 特任教授となった．これに伴い研究室の移動に時間を要した. しかし, それらは予定通り完了し, 新しい体制で研究を進める体制が整備された.
初年度の研究は今後の解析の基礎となる方法の開発を重点的に行なった. その結果, Kaiタンパク質の精製, 熱処理による混入活性の除去, 放射性同位元素による定量の高精度化, タンパク質結晶作製のためのシステムなどの開発が行なわれ, ２５年度以降の基礎を固めることができた．具体的な解析の進展としては，ATPaseの温度ステップに対する応答，6量体生成後ATPaseの変動を調べ，KaiC 内に緊張状態が生成していることを示した．また，CIIにおけるリン酸化機構の解析，CI-CII間のカップリング異常変異体の解析が進んだ．
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の計画に従って，「KaiCのATPase活性とリン酸化サイクルのメカニズムの解明」および「KaiCの構造生物学的解析／生物物理的機能解析」を強力に推進する．さらに真核生物の概日リズムの特性を決定するタンパク質のスクリーニングについてもKaiC蛋白質の特徴を生かし，様々な可能性を追求する．２５年度は，時間分解能の高いATPase活性の測定を軌道に乗せ，様々変異体や条件で解析を進め，仮説の検証につとめる．またこの条件で新たな変異体のスクリーニングを開始する．一方，構造生物学的解析では高分解能な結晶の作成をめざし，様々な可能性を追求する．
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