2012 Fiscal Year Annual Research Report
マルチカラーイメージング手法を用いた神経細胞内Ｍｇイオンダイナミクスの包括的理解
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24240045
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Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Research Institution | Keio University |
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Principal Investigator |
岡 浩太郎 慶應義塾大学, 理工学部, 教授 (10276412)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
鈴木 孝治 慶應義塾大学, 理工学部, 教授 (80154540)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | Ｍｇ動員 / ミトコンドリア / GABA / リン酸化酵素 / 新規Mgプローブ / FRET / 一酸化窒素（NO） |
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| Research Abstract |
細胞内Mg動態を調べることを目的として、新規蛍光プローブの開発、神経細胞内Mgイオン動員メカニズムの解析を並行して進めてきた。
従来我々が開発してきたMgプローブKMG-104は単一蛍光プローブであるため、レシオメトリックな計測を行うことができなかった。そこで新規なレシオメトリック型蛍光プローブの合成を行い、その応答を細胞内で評価した。大過剰なMgイオン濃度変化に対してこのプローブは応答したものの、強いpH依存性とMgイオンに対するKd値が生理濃度と比較して高いことが判明したため、さらに改良する必要があることが判明した。またこれと並行して、細胞局所でのMgイオン濃度計測を可能とする新規なKMG-104型プローブの開発を進めている。このプローブはタンパク質に導入したテトラシステインタグに結合し、Mgイオン濃度に応じて蛍光強度が大きく変化する。このプローブを用い、ミトコンドリア内膜を脱分極させる刺激を加えた際の応答を調べたところ、ミトコンドリア内膜近傍空間で急峻なMgイオン濃度上昇を計測することに初めて成功した。またさらにFRET型Mgプローブの開発にも着手した。
またKMG-104を用いて、神経細胞に一酸化窒素（NO）刺激を加えた際、ミトコンドリアからのMg放出が起きることを明らかにした。この減少は、NO/cGMP/PKGのシグナル伝達が関係しており、PKGによりミトコンドリア内膜に存在する特定のKイオンチャネルが開口することにより、ミトコンドリア内膜が脱分極して、それに伴ってMgが放出されるものと考えられる。
抑制性神経伝達物質GABAを海馬神経細胞に添加したところ、Mg動員を誘引することを見いだした。この現象は、代謝依存型およびイオンチャネル型のGABA受容体を介したシグナル伝達であることを明らかとした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
本計画では既存の当研究グループが開発してきたMgプローブを利用して、新規なMgイオンの役割を神経細胞について明らかにするとともに、多くの研究者が利用することが可能な新規なプローブの開発を並行して進めることを目論んでいる。神経細胞について新しいMg動員機構を見いだすことに成功することができただけでなく、利用対象と方法が異なる新規な3種類のMgプローブの開発についても目処がたって来ている。
①新規な細胞内Mg動員機構の解明：神経細胞について、一酸化窒素（N０）および抑制性神経伝達物質であるGABA刺激に伴う細胞内Mg動員を見いだした。これらのMg動員メカニズムついて、細胞外および細胞内オルガネラ（ミトコンドリア）からの細胞質へのMg流入が原因であることを突き止め、また種々のリン酸化酵素がこれらのMg動員を制御しているという従来知られていなかった全く新しい知見を得ることができた。これらの結果は現在NOに関しては投稿中であり、またGABAについても投稿準備中である。また膜電位脱分極がやはり細胞内Mg動員を行うことを見いだしたこと（未発表）から、通常の神経活動にMg動員が大きく関わっている可能性がある。
②新規プローブの開発：細胞局所でのMg濃度変化を高感度で計測可能な新規プローブの開発に成功し、ミトコンドリア近傍およびアクチンフィラメント近傍での局所Mg濃度計測に世界で初めて成功した（投稿準備中）。またKMG104を蛍光比計測可能なプローブに改変することを進めており、pH依存性があるという問題点を克服することにより、カルシウムイメージングで用いられている種々のプローブと同様程度の使い勝手のよいプローブの開発への目処が立った。また現在蛍光タンパク質ベースのFRET型Mgプローブの開発も並行して進めており、2分子FRETでは細胞内でMg応答が得られるという予備的なデータが得られつつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
①KMG-104 および開発中の新規プローブを用いて、細胞内Mg動員の生理的な役割について明らかにすることを進める。特に神経細胞以外の細胞についても新たな細胞内Mgイオンの役割が急速に明らかになってきていることから、細胞分裂等に関わる細胞現象とMgイオン動員との関係についても明らかにすることを進める。
②iPS細胞より分化誘導させた神経細胞の特徴付けをMg動員機構と関係させて進める。神経細胞への分化誘導を行う実験系は順調に整備ができており、細胞内カルシウムイオン応答とCREBリン酸化との関係について予備的な調査を進めている。今後は細胞内Mg動員と種々のイメージング技術とを併用して、分化神経細胞とパーキンソンおよびアルツハイマー患者由来iPS細胞についても、そのMg動員機構の差異について、種々の薬理実験とイメージングを併用して明らかにして行く。
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