2013 Fiscal Year Annual Research Report
樹状ナノ粒子（デンドリマー）の生体影響評価に関する研究
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24241013
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| Research Institution | National Institute for Environmental Studies |
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Principal Investigator |
福田 秀子 (曽根 秀子) 独立行政法人国立環境研究所, 環境リスク研究センター, 室長 (60280715)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
黒河 佳香 独立行政法人国立環境研究所, 環境リスク研究センター, 主任研究員 (30205231)
TIN・TIN Win・Shwe 独立行政法人国立環境研究所, 環境健康研究センター, 主任研究員 (00391128)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | ナノマテリアル / 樹状分子 / デンドリマー / 点鼻投与 / ナノ毒性 |
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| Research Abstract |
昨年に引き続き１）分散性の評価、２）生体内分布の評価、３）細胞レベルでの分布・反応評価に関して実験研究を行った。１）分散性の評価に関して、培養液や体液中でのPAMAMデンドリマーの分散性を調べるための方法論を模索した。その結果、他の高分子が共存する液中での粒径分布の評価には、Field Flow Fractionation (FFF)による蛍光標識デンドリマーの分離・蛍光検出、および蛍光相関分光法 (FCS)による蛍光強度ゆらぎ解析の２手法が有効であることがわかった。また、他の高分子が共存する液中での凝集の時間経過を評価するためには、２種類の蛍光物質で標識したデンドリマーを用いて蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を解析する方法が有効になりうることもわかった。さらに、デンドリマーの液中凝集のコンピュータ・シミュレーションを実施した。その結果、浮遊する凝集体・底面に付着する凝集体のいずれも、フラクタル次元が２前後の分枝状の塊となることがわかった。この結果は、ほぼ全てが球状塊として観察された走査型プローブ顕微鏡での観察と異なっており、凝集モデルの理論式に凝集後に現れる何らかの収縮力を組み込む必要性が示唆された。２）生体内分布の評価では、マウスに蛍光標識デンドリマーの純水けん濁液を点鼻投与し、投与１時間後及び１日後に脳を摘出して凍結切片標本を作製し分布の有無を共焦点レーザースキャン顕微鏡で調べたが、デンドリマー由来の蛍光は検出されなかった。しかし、24時間後の嗅球、海馬及び大脳皮質の脳の3領域における遺伝子発現プロファイルでは対照群と比べ、デンドリマー投与群で2倍以上の変化が認められた。３）細胞レベルでの分布・反応評価に関する研究では、表面がカチオンのアミノ基の場合に毒性が強かった。また、2D培養では、細胞内のリソゾームに蓄積した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の計画どおり、１）分散性の評価に関して、体液と似た組成の液相に懸濁した状態でデンドリマーがどのような比率・時間経過で凝集、拡散・沈降するかを詳細に調べる。デンドリマー自体の物性（サイズ、比表面積、表面電荷、フラクタル次元、細孔性など）を変えたうえで計測をくりかえすことができた。２）生体内分布の評価では、体内分布の実測を蛍光標識のデンドリマーを成獣に単回で点鼻投与し、分布を観察した。マイクロアレイより組織のゲノミクス解析を行った。しかし、末梢血を用いて血中半減期を計測し、さらにメタボノミクス法により全身代謝への影響を調べることに関しては行っていない。また、模擬試験系における動態の計測として、血液-脳関門（BBB）の通過モデル実験を行い、蛍光標識デンドリマーの通過の度合いと物性との関連を調べた。３）細胞レベルでの分布・反応評価では、細胞内分布に関する研究：蛍光標識デンドリマーを培養系に添加し、デンドリマーの細胞内分布を共焦点蛍光顕微鏡で調べた。さらに、多能性細胞（ES細胞）の未分化時期にデンドリマーを培養液に添加し、細胞の変化の量反応関係及び経時変化を観察した。
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| Strategy for Future Research Activity |
１）分散性の評価に関して、今年度は、他の高分子が共存する液中での粒径分布の評価には、Field Flow Fractionation (FFF)による蛍光標識デンドリマーの分離・蛍光検出、蛍光相関分光法 (FCS)による蛍光強度ゆらぎ解析及び蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）であることがわかったので、これら3手法についてさらにデータを蓄積する。また、デンドリマーの液中凝集のコンピュータ・シミュレーションを実施した結果、走査型プローブ顕微鏡での観察とは異なった凝集態度であることが判明したので、凝集モデルの理論式を改善する。２）生体内分布の評価では、点鼻投与での分布反応に焦点を充てる。マウスに蛍光標識デンドリマーあるいは、分子内に蛍光物質を入れたカチオン粒子等を用いて、引き続き脳内の分布を調べる。３）細胞レベルでの分布・反応評価に関する研究では、表面がカチオンのアミノ基の場合に毒性が強かったため、そのメカニズムを調べる。
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