2013 Fiscal Year Annual Research Report
高速ＡＦＭ／一分子蛍光複合機で明らかにするリング状ＡＴＰａｓｅの協同的構造変化
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24241048
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
内橋 貴之 金沢大学, 数物科学系, 准教授 (30326300)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
渡辺 洋平 甲南大学, 理工学部, 准教授 (40411839)
飯野 亮太 東京大学, 工学(系)研究科(研究院), 准教授 (70403003)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 一分子計測 / 蛋白質 / ATPase / 走査プローブ顕微鏡 |
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| Research Abstract |
昨年に引き続き、好熱菌由来ClpBとその各種変異体を用いて6量体リングのATP加水分解依存的な構造ダイナミクスの高速AFM観察を進めた。昨年度に、ClpB-K721C変異体にビオチン標識を導入しストレプトアビジン基板に固定したところ、90%以上の分子においてリング構造が形成されていないことが判明した。この原因を調べたところ、基板に分子を強固に固定しているためであることが分かった。マイカ表面を基板に用いて、観察溶液の塩濃度や分子濃度を調整することでリング構造を壊すことなくClpB分子を基板に弱く吸着することができた。観察の結果、リング構造は円対称と非対称の2種類の構造が存在し、円対称なリングは6量体と7量体が混在していること、非対称なリングは6量体であることが分かった。さらに6量体リングはATPの濃度に依存して、対称・非対称な構造遷移を起こし、リングの切断と形成を繰り返すことを明らかにした。また、ClpB単量体の2箇所のATP結合サイトの両方、もしくは一方のATP加水分解能を阻害した変異体での測定や各種ATPアナログ存在下での6量体リングの観察により、D2サイトへの3個以上のATPの結合により円対称なリング構造が安定化されること、ATP加水分解によりリング構造が不安定化し、リングの切断もしくは非対称化が起こることなどを明らかにした。
高速AFM/蛍光顕微鏡によるATPaseリング構造の同時観察では、F1-ATPaseの構造変化と蛍光性ATPの同時観察に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ClpBの6量体構造が非対称リングであり、ATPの結合と加水分解によって、リング構造の切断と修復、非対称化という大きな構造変化を起こしているという予想外の結果が得られたため。また、高速AFM/蛍光顕微鏡によるATPaseの構造変化と基質結合の同時観察も順調に進んでいるため。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、ClpBの6量体リングの構造ダイナミクスが凝集基質の結合と脱凝集機能にどのように関わっているかを明らかにする。また、高速AFM/蛍光顕微鏡観察によるF1-ATPaseの構造変化とATP結合の同時観察を進めそれらの相関を明らかにする。さらに、高速AFM/蛍光顕微鏡をClpBの構造ダイナミクスとATP結合の同時観察にも適用していく。
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[Journal Article] ingle-molecule imaging analysis of elementary reaction steps of Trichoderma Reesei cellobiohydrolase I (Cel7A) hydrolyzing crystalline cellulose Iα and IIII2014
Author(s)
Y.Shibafuji, A. Nakamura, T. Uchihashi, N. Sugimoto, S. Fukuda, H. Watanabe, M. Samejima, T. Ando, H. Noji, A. Koivula, K. Igarashi, R. Iino
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Journal Title
Journal of Biological Chemistry
Volume: 印刷中
Pages: 印刷中
Peer Reviewed
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