2012 Fiscal Year Annual Research Report
進化工学的手法により分子構築した宿主可変ファージによる感染症の制御
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24246133
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Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
丹治 保典 東京工業大学, 生命理工学研究科, 教授 (00282848)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宮永 一彦 東京工業大学, 生命理工学研究科, 助教 (40323810)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | バクテリオファージ / ファージセラピー / 乳房炎 / 黄色ブドウ球菌 / 薬剤耐性菌 |
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| Research Abstract |
家畜感染症の中で最も深刻な被害をもたらしている牛乳房炎(細菌が乳頭口を通し感染することにより発症する疾患の総称)へのファージセラピー（バクテリオファージによる感染症の治療）を目標に、黄色ブドウ球菌特異的ファージ2種（fSA012,fSA039）をスクリーニングし、解析を進めた。協力研究機関である酪農学園大が北海道地区の酪農家から得た乳房炎罹患牛乳汁から黄色ブドウ球菌をスクリーニングし、Multiplex-PCRにより150種以上に分類した。2種のファージはこれらの黄色ブドウ球菌に対し広いホストレンジを示した。特に、fSA012は特定されたすべての黄色ブドウ球菌に感染性を示し、さらにヒト由来MRSAにも感染性を示した。また次世代DNAシーケンサーを用いて2種のファージの全ゲノム配列を特定した。しかし、既存の黄色ブドウ球菌特異的ファージの遺伝情報と相同性検索を行ったが、利用できる情報は限られ、数種の例を除き各ORFがコードするタンパク質の機能を類推することはできなかった。
fSA012を牛乳房で作用させると様々な問題が生じる。黄色ブドウ球菌は乳房内で葡萄の房状の凝集体を形成する。凝集体を形成した黄色ブドウ球菌は抗生物質に対し抵抗性を示すと同時にファージの感染も回避することが考えられる。そこで、黄色ブドウ球菌の乳房炎内凝集機構を解明するとともに、凝集体を形成した黄色ブドウ球菌に対するファージの感染性を評価した。乳房炎罹患牛からスクリーニングした黄色ブドウ球菌は一般培地では凝集体を形成しなかった。源乳から脂肪を除いたスキムミルク、さらにラクトースとカゼインを除いたホエーに分画し凝集性を解析したところ明確な凝集体を形成した。そこでホエーを構成する各タンパク質の凝集能を評価したところIgGが濃度依存的に黄色ブドウ球菌を凝集させることが判明した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
先行研究でスクリーニングした2種のファージの特性解析が進展した。一般にファージの宿主特異性は高く、一種のファージで複数の病原菌を制御することは難しい。しかし、研究に使用したfSA012は北海道地区でスクリーニングされた150種以上の黄色ブドウ球菌に対し感染性を示し、さらにその制御が難しいことが指摘されているMRSAに対しても感染性を示した。使用したファージを用いれば北海道地区で黄色ブドウ球菌に起因する乳房炎を一種のファージで制御できる可能性が示唆された。一方、試験管内環境と乳房内環境は異なる。黄色ブドウ球菌の名が示すように同菌は葡萄の房状凝集体を形成することで宿主の免疫能や投与された抗生物質の作用を回避する。ファージで黄色ブドウ球菌を制御する際も宿主の凝集化は大きな課題である。昨年度の研究により、黄色ブドウ球菌のIgG依存的凝集能が示された。しかし、なぜIgGが菌体の凝集を促すのかその機構は不明である。
一方、次世代シーケンサーを用いることで、2種のファージの全ゲノム解析が終了した。それぞれのファージは約15万base-pairの2本鎖DNAから成る。しかし、黄色ブドウ球菌特異的ファージの遺伝情報は限られる。データベースとの対比からファージがコードするすべてのタンパク質の機能を類推するまでには至っていない。特に本研究テーマの要であるファージが宿主を認識する際に使用するリガンドを特定することはできなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
本申請研究では進化工学的手法を用い、ファージのリガンドタンパク質を改変し、高い結合能と広宿主域を併せ持つキメラファージの分子構築を行うことを最大の目標としている。しかし、既存のデータベースとの比較からリガンドタンパク質を同定することは難しいことが判明した。そこで以下の手順によりリガンドタンパク質の同定を試みる；①fSA012と乳房炎罹患牛から単離した黄色ブドウ球菌を長期間接触させる。②回分培養を長期間続けることにより、ファージ耐性菌と耐性菌感染性ファージを複数得る。③ファージ耐性菌はファージに対するレセプタータンパク質を、耐性菌感染性ファージはリガンドタンパク質を変異させている可能性が高い。そこで、耐性菌感染性ファージの構造タンパク質をコードしていると予想されるORFを複数候補に挙げ、各ORFのDNA配列を読む。変異が蓄積しているORFがリガンドタンパク質の候補となる。④候補リガンドをコードする遺伝子を用い黄色ブドウ球菌を形質転換し、さらに野生型ファージを感染させ、相同組換えにより野生型ファージの宿主域の変換を解析する。本方法でリガンドタンパク質が同定できたら、リガンドをコードする遺伝子断片に進化工学的手法を用い変異を導入し、宿主に対する感性能がより優れたキメラファージの分子構築を試みる。
一方、牛乳房炎のファージセラピーを実践するために、協力研究機関である酪農学園大学で、生牛を用いた実証試験を目指す。酪農学園大学では当研究室から提供されたファージを乳房炎モデルマウスに投与し、その有効性をすでに実証した。しかし、生牛を用いた実証試験計画はまだ学内審査を通過するまでに至っていない。実験計画が承認された際には、ファージの大量精製と、同大学においてファージ投与後の牛生体内での消長を解析する。
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