2013 Fiscal Year Annual Research Report
進化工学的手法により分子構築した宿主可変ファージによる感染症の制御
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24246133
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
丹治 保典 東京工業大学, 生命理工学研究科, 教授 (00282848)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宮永 一彦 東京工業大学, 生命理工学研究科, 助教 (40323810)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | バクテリオファージ / 黄色ブドウ球菌 / 乳房炎 / ファージセラピー |
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| Research Abstract |
申請者らは10年以上に渡り、大腸菌O157:H7や黄色ブドウ球菌特異的バクテリオファージ（ファージ）を自然界からスクリーニングし、病原菌のファージによるコントロール(ファージセラピー)を提唱してきた。平成25年度はスクリーニングした黄色ブドウ球菌特異的ファージと宿主の相互作用を解析することにより、ファージの宿主認識に関わる部位を特定することができた。また宿主認識の特異性を人為的に変換するためのデバイスとしてCRISPR-Casシステムを導入し、大腸菌ファージを例にファージの特定遺伝子を排除し、人為的に作成した遺伝子断片と入れ替えることに成功した。本研究の最終目標はファージの宿主認識に関わる分子機構を解明し、進化工学的手法を用い、宿主認識を自在に改変するための分子構築法を確立にある。スクリーニングに頼らない様々な病原菌に感染性を持つキメラファージの構築を可能とし、ファージセラピーの実践、またはファージによる病原菌の迅速検出技術の確立に寄与することを最終目的とする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成25年度に受理された論文は無かったが、成果をGenomic analysis and determination of host recognition proteins in staphylococcal Twort-like phages､ Coevolution between Staphylococcus aureus Isolated from Mastitic Milk and its Lytic Bacteriophage ΦSA012 in Batch Co-culture with Serial Transfer、IgG dependent aggregation of Staphylococcus aureus evades bacteriophage attackと題した3報の論文にまとめ投稿した。黄色ブドウ球菌特異的ファージfSA012のリガンドが特定されたことは本申請研究の要となるファージ宿主域のスイッチングには必須のことであり、平成26年度は新たに導入したCRISPRシステムを用い、進化工学的手法により特定したリガンドに変異を導入する計画である。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成26年度は以下に示す三つの研究項目を挙げ研究を実施する
１．今年度は候補部位がリガンドであることを確定するために、リガンド候補部位をコードする遺伝子断片を野生株fSA012に戻すことで宿主認識の特異性が変異ファージ同様スイッチングするかを確かめる。さらにリガンド候補部位の抗体を作成し、リガンドの発現部位であるファージテールファイバー先端にリガンドが位置することを確かめる。
２．リガンドに進化工学的手法を用いて感染特異性を人為的に改変した新規ファージの分子構築を試みる。黄色ブドウ球菌を標的としたファージの分子構築を目指すが、黄色ブドウ球菌の遺伝子改変ツールは限られる。そこで今年度は最初に大腸菌ファージを例に改変ファージの分子構築システムを確立する。前年度CRISPR-Casシステムを導入した。本システムにより変位導入箇所を特異的にマスクすることが可能となった。同システムにより大腸菌ファージの宿主認識部位を削除し、同部位にランダムな変異を導入した遺伝子断片を含むプラスミドにより形質転換した大腸菌にファージを感染させることでプラスミド-ファージゲノム間における遺伝子の相同組換えを誘発し、組換えファージを得る。得られた変異ファージセラピーのプールを標的大腸菌（大腸菌O157:H7）に感染させ、よりタイトに結合するファージを選択することで目的とするキメラファージを得る。
３．前年度の研究でIgG存在下、黄色ブドウ球菌が凝集体を形成することが判明した。凝集体を形成した黄色ブドウ球菌にファージfSA012を添加すると、懸濁状態よりファージによる菌体の制御が難しくなる。おそらくファージの凝集体内拡散が律速となるためと考えられる。このことは牛乳房炎のファージセラピーを実践するための大きな障壁となる。今年度はIgG依存的黄色ブドウ球菌の凝集機構を解明し、凝集体分散の手法を検討する。
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