2015 Fiscal Year Annual Research Report
進化工学的手法により分子構築した宿主可変ファージによる感染症の制御
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24246133
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
丹治 保典 東京工業大学, 生命理工学研究科, 教授 (00282848)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宮永 一彦 東京工業大学, 生命理工学研究科, 助教 (40323810)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2017-03-31
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| Keywords | バクテリオファージ / 黄色ブドウ球菌 / ファージセラピー / 乳房炎 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
牛乳房炎罹患牛の乳汁からスクリーニングした黄色ブドウ球菌（SA003）と下水流入水からスクリーニングしたファージ(ΦSA012)を用い38回培養を繰り返し、出現したファージ耐性化黄色ブドウ球菌と耐性化黄色ブドウ球菌に感染性を獲得した変異ファージを時系列的に分離することができた。次世代DNAシーケンサーを用い、幾つかの変異ファージと黄色ブドウ球菌の全ゲノム配列を解析し、両者の共進化における分子メカニズムを明らかにすることができた。ファージ耐性化宿主の全ゲノム解析から、細胞壁合成に関わるTarO遺伝子の欠損が同定され、同欠損変異をTargetronシステムを用いて宿主に導入したところ、ファージ耐性化が示された。細胞壁に発現される糖鎖構造がファージのレセプターであることが分かった。一方、耐性化宿主に感染性を獲得したファージの全ゲノム解析から宿主を認識するリガンドとして二つのタンパク質（gp103,105）が同定された。
大腸菌O157:H7特異的ファージPP01の宿主認識に関わる二つのリガンドタンパク質（gp12,38）をコードする遺伝子を非病原性大腸菌K12感染性ファージT2にCRSPR/Casシステムを用い導入することができた。組換えT2ファージはPP01同様、大腸菌O157:H7に吸着性を示したが、宿主の溶菌を伴う感染性は示さなかった。吸着以降に感染に不可欠な工程が存在することが示された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は抗生物質に代わり、ファージセラピーによる感染症の制御を目指している。着目したのは家畜の感染症の中でも特に問題視されている牛乳房炎である。本研究の特長はファージセラピーを具現化するために、ファージの宿主認識に関わる分子メカニズムを解析し、ファージの宿主認識特異性を人為的にスイッチングする方法を開発することにある。乳房炎罹患牛からスクリーニングした黄色ブドウ球菌(SA003)と下水流入水からスクリーニングしたファージ(ΦSA012)の感染実験により、ファージが宿主吸着時に利用するレセプター候補を同定した。ファージ耐性菌の全ゲノム解析からレセプターは細胞壁に発現されるタイコ酸（Teichoic Acid）であると考えられる。一方、ファージがレセプターに結合する際のリガンドタンパク質の候補を二つ（gp103，105）を同定した。さらなる解析によりレセプターとリガンドを決定する必要がある。
進化工学的手法によりファージのリガンドに変異を導入し、宿主認識特異性を人為的にスイッチングするためには高効率でファージゲノムに変異を導入する手法の開発が必要である。遺伝子組換えのシステムが整っている大腸菌を用い、変異導入システムの検討を行った。対象としたのは非病原性大腸菌ファージT2と病原性大腸菌O157:H7特異的ファージPP01の組換えである。CRISPR/Cas systemを用いることでT2ファージに効率的かつ簡易に変異を導入することができ、組換えT2ファージは大腸菌O157:H7にPP01と同じ結合力で吸着することが実証された。
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| Strategy for Future Research Activity |
研究は黄色ブドウ球菌SA003と黄色ブドウ球菌ファージΦSA012株を用い、牛乳房炎のファージセラピーを目指す研究と、大腸菌の系を用いファージのリガンドをコードする遺伝子領域に高頻度で変異を導入するシステムを開発し、進化工学的手法により大腸菌ファージの宿主認識特異性を人為的にスイッチングするするシステムの開発に分けて行う。
今までの研究によりSA003のファージレセプターとΦSA012のレセプター認識リガンドタンパク質候補をそれぞれ見出すことができた。ファージがコードするgp103及びgp105は宿主レセプターを認識するリガンドタンパク質である可能性が高い。そこで両タンパク質をコードする遺伝子断片を大腸菌プラスミドにクローニングし、GFP融合タンパク質として発現する。タンパク質を分離精製しSA003に対する親和性を解析する。また両タンパク質に対する抗体を作成し、抗体が競争的にリガンドとレセプターの結合を阻害するか確かめる。ファージのリガンドを特定できたなら、両ORFに進化工学的手法を用い変異を導入し、ΦSA012の宿主認識特異性を人為的にスイッチングする。
進化工学的手法で組換え体ファージを分子構築する手法の開発は大腸菌のシステムを用い行う。T2ファージはK12大腸菌には感染できるがO157:H7には感染できない。一方、PP01ファージはO157:H7に感染できるがK12株には感染できない。T2ファージの宿主認識特異性を司るのはgp38であることを明らかにした。また、CRISPR/Cas systemを用いることにより効率的かつ簡易にファージに変異を導入することができるようになった。本年度はCRISPR/Cas システムを用いファージの改変を行い、PP01ファージの大腸菌O157:H7感染の分子メカニズムを詳細に検討することにより､大腸菌ファージの分子育種を目指す。
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