2012 Fiscal Year Annual Research Report

クロマチンループ構造変換による組織特異的Ｓｈｈ発現制御システム

Research Project

Project/Area Number	24247002
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
Research Institution	National Institute of Genetics
Principal Investigator	城石俊彦国立遺伝学研究所, 系統生物研究センター, 教授 (90171058)
Project Period (FY)	2012-04-01 – 2015-03-31
Keywords	遺伝学 / ゲノム / 発現制御 / マウス / 発生・分化
Research Abstract	１．Cre-loxpシステムを用いた条件的KOマウスによるCTCFの機能解析のために、肢芽の間充織特異的なpPrx1-Creと上皮に特異的なpMsx2-Cre、ユビキタスプロモーターのCAGGSに誘導型CreERT2をもつマウスラインをそれぞれ作製した。これらのマウスとCTCF条件的KOマウスの交配による形態の表現型解析が進行中である。 Shh遺伝子座周辺の7ヶ所をベイトとして設定し、マウス肢芽に対する4C-Seq解析を行い、相互作用する未知領域を網羅的に同定した。さらに、肢芽と頭部から試料を調製し、CTCF、Mau2、Smc1aに対する抗体を用いて、ChIP-Seq解析を行った。これらの次世代シーケンサーを用いた大規模な配列決定には、「ゲノム支援」のサポートを受けた。現在、配列情報の解析処理を行っている。２.ゲノム情報学的に、喉頭形成に必須なMACS1の祖先型が、軟骨魚類出現以前に存在していたことを明らかにした。さらに条鰭類、肉鰭類への分岐後、肺呼吸をしない条鰭類の一部では、祖先型MACS1は、痕跡の一部を残し崩壊していることがわかった。この崩壊により喉頭をもたない魚胚ではMACS１の機能は失われているが、その近傍に咽頭、食道部位に発現を誘導する魚型エンハンサーを獲得していることがわかってきた。さらに、レポーター遺伝子の発現解析から予測されるMFCS4とMRCS1間の機能の重層化を検証する目的で、欠失マウスを作成した。一つは、TAMERE法で作出したMFCS4とMRCS1間の127kb欠失マウスである。加えてMRCS1KOマウスから樹立したES細胞を用い、MRCS1とMFCS4のダブルKOマウスを新たに作成した。今後これらと個々のKO マウスの表現型を比較することにより、歯プラコードを中心とした口腔の表現型解析を総括的にすすめる。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 三種類の組織特異的Creマウスに関しては、Rosa26Rマウスを用いた発現解析により、Creの発現が最も安定しているラインを各々選別済みである。すべてのラインに関して、CTCFのKOヘテロマウスとの交配により、CTCF KOアリルとCreとのヘテロオス個体を得ている。特に肢芽特異的Creマウスに関しては、CTCFの条件的KOマウスとの交配により、骨格パターンの解析が一部進行している。 4C-SeqとChIP-Seqに関しては、サンプルの調製と次世代シーケンサーによる配列決定がすでに完了しており、それぞれのショートリードに対する情報処理を行っている。特に興味深いゲノム領域に関しては、組織を変えて3C法とCTCF抗体によるChIPを行い、定量PCRをする個別の解析を始めている。遠隔エンハンサーMACS1の進化と喉頭器官の形態進化の関連及び複数のエンハンサーの重層化と形態多様化との関連を明らかにする計画についてはほぼ順調にすすんでいる。MACS1の喉頭での機能に必須な配列に結合する転写因子の同定については、複数のHLH型転写因子Fox (Foxa, Foxp, Foxfなど)から絞り込む準備段階にある。
Strategy for Future Research Activity	Shh遺伝子の発現低下は肢芽組織の大規模な欠損を引き起こす。CTCFのターゲッティングが効果とShh低減に伴う副次的効果を区別するため、MFCS1でドライブされるShhのトランスジーンを用いて、Shhの発現レベルを正常と同程度に保ち、CTCFの四肢形態とShh遺伝子座の染色体ダイナミクスへの影響を評価する。また、同様の目的で、Shhシグナリングの下流をレスキューするためにGli3遺伝子の変異であるXtミュータントも用いて染色体構造の解析を行う。我々は、Shh上流100 Kbに肺と消化管で機能する新しいエンハンサー配列を同定した。この配列はレポータートランスジェニックアッセイにおいて、既報のMACS1と一部類似の発現パターンを示す。この新規配列の機能を明らかにするため、KOマウスを作製し、MACS1 KOマウスと表現型の相違を明らかにする。口腔上皮のShh発現も複数のエンハンサーが関与する複雑な制御を受けている。これらの効果を正しく評価するため、歯の原基で機能するMFCS4とMRCS1エンハンサーのダブルノックアウトマウスを用いてShhの発現レベルと歯を含む口腔構造への影響を解析する。さらに、TAMERE法により作製したMFCS4とMRCS1を含む127kbのゲノム領域を欠失したマウスでも同様の解析を行って、二つの口腔上皮エンハンサーがShh発現においてどのように共役しているのか解明する。また、MFCS1-MACS1間の105 Kbに関してもTAMERE法を利用して欠損マウスを作製する。これらの長距離欠損マウスに対して、3C法による染色体相互作用の解析を行い、大きなゲノム領域の消失がどのように染色体ループ構造を変化させるのか調べる。この際、Shhを発現する肢芽・口腔上皮・消化管・神経管などの織特異的な染色体構造の有無に着目する。