2014 Fiscal Year Annual Research Report
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24247014
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
深井 周也 東京大学, 放射光連携研究機構, 准教授 (10361792)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 分子認識 / DNA修復 / タンパク質複合体 / ユビキチン / X線結晶構造解析 / 構造生物学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ユビキチンは，タンパク質分解をはじめとする多様な細胞機能を制御するシグナル分子としての役割を担うが，複数のユビキチン分子が数珠つなぎになったポリユビキチン鎖として機能する例が多く知られる．本研究では，DNAの損傷応答を制御するK63結合型ユビキチン鎖の合成・分解・認識に重要なタンパク質複合体（OTUB1-Ubc13-Mms2伸長抑制複合体， BRCC36脱ユビキチン化酵素複合体とユビキチン鎖との複合体，RNF168のUMIドメインとユビキチン鎖との複合体など）の立体構造を決定し，構造情報に基づいて設計した変異体の機能解析をin vitroおよびin vivoで行うことによって，K63結合型ユビキチン鎖を介したDSB応答のメカニズムを原子の解像度で明らかにすることを目的とする．今年度は，BRCC36脱ユビキチン化酵素複合体について，4つあるいは3つのサブユニットを共発現させることで，結晶化に十分な質と量の試料を調製し，結晶化スクリーニングを行った．全長のサブユニットで構成される複合体では結晶が得られなかったので，構造が不安定と予測される領域を削ったり，生物種を変更したりすることによる試料の改良を検討した．また，K63結合型ユビキチン鎖との複合体の結晶化に向けて，切断活性を持たない変異体を調製した．昨年度に解析したDNA損傷応答に関わる新規のユビキチン結合タンパク質であるFAAP20のZnフィンガードメインとユビキチンの複合体に関する研究成果をまとめて論文として発表した．RNF168-UMIとユビキチンとの複合体については，UMI以外の領域の機能について興味深い知見が報告されたので，その情報を基にして新たに構造解析を開始した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初計画した３つの複合体（OTUB1-Ubc13-Mms2伸長抑制複合体， BRCC36脱ユビキチン化酵素複合体とユビキチン鎖との複合体，RNF168のUMIドメインとユビキチン鎖との複合体）のうち，OTUB1-Ubc13-Mms2伸長抑制複合体とRNF168のUMIドメインとユビキチンとの複合体の構造決定を終えている．OTUB1-Ubc13-Mms2伸長抑制複合体については，機能構造相関を明らかにした成果を論文として発表している．RNF168とユビキチン鎖との複合体については，構造決定も含めて研究成果が得られているが，新たに報告された知見をもとに，詳細な機能を解明するための構造解析を開始した．BRCC36脱ユビキチン化酵素複合体については，構造解析に適する試料調製方法を確立して結晶化に近づくと共に，電子顕微鏡による解析も検討中である．また，DNA損傷応答に関わる新規のユビキチン結合タンパク質であるFAAP20のZnフィンガードメインとユビキチンとの複合体に構造機能解析を行い，その成果を論文として発表した．
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| Strategy for Future Research Activity |
当初計画の内，２つの複合体について解析を終え，残る複合体はBRCC36脱ユビキチン化酵素複合体のみとなった．BRCC36複合体については，全体の分子量が160 kDaの真核生物由来の複合体であることから，大量調製が一つの大きな壁であったが，研究の進展により，構造解析に十分な質と量の複合体を調製することが可能になった．不安定な領域のトリミングや構造解析に最適な生物種の検討などの工夫により結晶化に近づいており，引き続き試料の改良を行う．並行して，近年技術革新が進んで高分解能での解析が可能となってきている電子顕微鏡による解析も試みる．
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Research Products
(4 results)
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[Journal Article] Structural basis for ubiquitin recognition by ubiquitin-binding zinc finger of FAAP202015
Author(s)
Toma, A, Takahashi, T. S., Sato, Y., Yamagata, A., Goto-Ito, S., Nakada, S., Fukuto, A., Horikoshi, Y., Tashiro, S., Fukai, S.
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Journal Title
PLoS One
Volume: 10
Pages: e0120887
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Acknowledgement Compliant
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[Journal Article] Structures of CYLD USP with Met1- or Lys63-linked diubiquitin reveal mechanisms for dual specificity2015
Author(s)
Sato, Y., Goto, E., Shibata, Y., Kubota, Y., Yamagata, A., Goto-Ito, S., Kubota, K., Inoue, J., Takekawa, M., Tokunaga, F., Fukai, S.
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Journal Title
Nature Structural & Molecular Biology
Volume: 22
Pages: 222-229
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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