2013 Fiscal Year Annual Research Report
細胞膜上マクロ構造体の形成と機能の機構：１分子イメジングによる解明
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24247029
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
楠見 明弘 京都大学, 物質-細胞統合システム拠点, 教授 (50169992)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
笠井 倫志 京都大学, 再生医科学研究所, 助教 (20447949)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 細胞生物物理 / 1分子計測・操作 / メゾスコピック系 / 生体分子 / 細胞膜の動的構造 |
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| Research Abstract |
細胞膜上には、直径が500nmを超えるマクロ構造体が多数存在し、重要な機能を果たしている。本研究では、このような構造体の中で主に接着斑（FA）をとりあげ、微細構造と、形成・分解の制御機構を解明することを目的としている。また、この研究を、シナプスの構造形成にも敷衍する予定である。方法としては、構成分子のリクルートや交換を、３種分子同時・世界最速の1分子イメジング法で直接に観察するという、ユニークな方法を用いている。
初年度までの研究で、FAは、今まで信じられていたようなタンパク質の巨大集積体では全くないことがわかった。細胞膜中の分子は、FAにほぼ自由に出入りする。すなわち、FA領域は、基本的には、その外側の細胞膜と同様、液体性の膜からできており、その中に、FAの構造タンパク質が作る小さな島のようなタンパク質集合体が散在するという『群島構造』をとっていることが分かってきた。
本年度は、FA内での分子の拡散挙動をさらに詳しく調べることにより、群島構造の解明を進めた。まず、FA内でのトランスフェリン受容体の拡散挙動を、超高速1分子追跡法を用いて詳しく調べた。その結果、トランスフェリン受容体は、FA外の細胞膜と同様、ホップ拡散することが示された。すなわち、FA内部でも、アクチン膜骨格の網目で液性の細胞膜は仕切られており、その中に、FAタンパク質の島が散在することが示唆された。ラフト分子がFA内で特異な運動をする可能性も指摘されてきた。そこで、これについても検討を加えたが、この可能性は打ち消された。FA内には、Rac1がリクルートされて来ることが昨年度までの実験で分かっていた。そこで、Rac1を活性化するPIXのリクルートを調べたところ、PIXは、細胞質から直接にFAにリクルートされて来ることが示され、これらの分子は、FAにリクルートされることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究では、様々な細胞膜上のマクロ構造体の形成原理と機能には、共通の基本戦略・原理があり、基本的に群島構造で理解できると考え、この解明を進めている。そのパラダイムとしてFAを用い、さらに、神経細胞間に形成されるシナプスについても、解明を進めている。予備検討と初年度の研究で、FA領域は、基本的には、FA外の細胞膜と同様、2次元の液体状の構造を持つことが分かってきた。その中に、FAを構成するタンパク質群が作る複合体（大きさ不詳）が、島のように散在していると考えられる。
本年度は、以下が解明された。（１）時間分解能100マイクロ秒という世界最速の1分子追跡法を用いて、FA内でのトランスフェリン受容体の拡散挙動を、詳しく調べた。その結果、トランスフェリン受容体は、FA外の細胞膜と同様、ホップ拡散することが示された。これは、極めて予想外の発見であった。すなわち、FA内部でも、アクチン膜骨格の網目で液性の細胞膜は仕切られており、その中に、FAタンパク質の島が散在することが明らかになった。この結果に基づき、現在、細胞外基質の受容体であるインテグリンの接着斑内での挙動を、詳しく調べている。（２）接着斑の裏打ちタンパク質分子の局在を、自作の超高速超分解蛍光顕微鏡で調べることが可能になった。そこで、FA内を拡散している分子との、時空間相関両者の関連を検討している。（３）ラフト分子がFA内で特異な運動をする可能性も指摘されてきた。そこで、これについても検討を加えたが、この可能性は打ち消された。（４）神経細胞の後シナプスについて、群島モデルの検証を始めた。まず、シナプスとは関連しない膜タンパク質Thy1が後シナプス膜に入るかどうかを調べたところ、かなり自由に入ることが分かってきた。
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| Strategy for Future Research Activity |
以下の計画にしたがい、研究を推進する。(1) 膜貫通型で細胞外基質の受容体であるインテグリンのFA領域内での挙動を解明する。FA領域内に入ったあとトランスフェリン受容体と同様にホップ拡散するのか、その後は、FAタンパク質からなる島に取り込まれるのか、その後の動態はどうか、などを解明する。(2) FA域内の流動性膜がアクチン膜骨格によって仕切られている可動化を明らかにする。トランスフェリン受容体は、FA外の細胞膜と同様、ホップ拡散することが示された。すなわち、FA内部でも、アクチン膜骨格の網目で液性の細胞膜は仕切られており、その中に、FAタンパク質の島が散在することが示唆された。この作業仮説に基づき、検討を進める。さらに、FA構成分子と周辺のカベオラや被覆ピットとの関連を明らかにする。(3) 神経細胞の後シナプスについて、群島モデルの検証を終える。まず、シナプスとは関連しない膜タンパク質Thy1が後シナプス膜に入るかどうかを調べたところ、かなり自由に入ることが分かってきた。この検討を終わらせる。さらに、シナプス内で働くNMDA受容体を1分子追跡して、Thy1の挙動との異同を明らかにする。後シナプスの裏打ちタンパク質として重要なHomer1bの作る領域の観察と、Thy1またはNMDA受容体の1分子観察を同時に行い、膜タンパク質とHomer1b領域の関係を解明する。
これらの観察によって、後シナプス膜の構造も群島モデルで説明できるという作業仮説の成否を明らかにする。そこで、FAと同様の手法で検討を進める。
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[Journal Article] Biocompatible fluorescent silicon nanocrystals for single-molecule tracking and fluorescence imaging2013
Author(s)
H. Nishimura, K. Ritchie, R. S. Kasai, M. Goto, N. Morone, H. Sugimura, K. Tanaka, I. Sase, A. Yoshimura, Y. Nakano, T. K. Fujiwara, and A. Kusumi
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Journal Title
Journal of Cell Biology
Volume: 202
Pages: 967-983
DOI
Peer Reviewed
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