2012 Fiscal Year Annual Research Report
試験管内再構成系を用いた相同組換え反応における時空間ダイナミズムの分子機構研究
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24247033
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Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
岩崎 博史 東京工業大学, 生命理工学研究科, 教授 (60232659)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 相同組換え / Rad51リコンビナーゼ / Ctp1 / 遺伝情報維持 / Swi5-Sfr1複合体 / 試験管内再構成系 / 分裂酵母 / Brca2 |
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| Research Abstract |
相同組換え (修復) は、大きく３ つの反応ステップ（初・中・後期） に分かれるが、本申請研究では、分裂酵母を主要な生物モデル系として、申請代表者らによって独自に発見された因子（Nip1/Ctp1、Swi5-Sfr1 複合体、 Fbh1 ヘリケースなど） を中心に、各ステップを再構成し、これらの因子がそれぞれの反応過程にどのように関与するのか、分子レベルでの解明、また、一部は、ヒトタンパク質ホモログを解析し、その普遍性の検討、さらに、各ステップ間を再構成し、ステップ間の連携機構の解明、最終的に、これらのアプローチより、時空間的にダイナミックな核内反応機構における分子反応機構解析のパラダイムの構築を目指している。
昨年度は、Ctp1タンパク質にエンドヌクレアーゼ活性を有することを発見した。また、Ctp1はカゼインキナーゼIIでリン酸化されるが、試験管内リン酸化反応系を構築し、リン酸化フォームによってNbs1と物理的相互作用が初めて可能になることを示した。また、発見以降１０年以上を精製が困難であったRad55-Rad57複合体の精製に成功した。遺伝学的なトリックを使ったスクリーニングによって、Sfr1による活性化を受けないRad51ミュータントを分離した。現在、その生化学的解析を行っているところである。Sfr1の分子解剖により、機能ドメイン（Rad51やDNAとのを結合部位）を明らかにした。Fbh1ヘリカーゼの精製方法を改良した。また、Fbh1ヘリカーゼよるRad51反応の制御機構について、新たに、正負の２面の効果を発見した。また、ヒトRad51の精製方法を改良して安定供給を可能とした。さらに、ヒトSwi5及びヒトSfr1の発現系を構築した。Brca2の発現精製系を検討し、改良しているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1) 初期過程の再構成系の構築と反応機構解析:初期過程には、Mre11, Rad50, Nbs1, Ctp1などが関与する。昨年度までに、これらの発現精製系を構築した。また、Ctp1にエンドヌクレアーゼ活性を発見した。Ctp1は、CK2によってリン酸化されることによって、Nbs1と結合することを見出した。
(2) 初期－中期過程の再構成系を用いた反応機構解析：Swi5-Sfr1ヘテロ２量体によるRad51の活性化機構を解析する目的で、遺伝学的なトリックを用いたRad51上のSfr1相互作用部位の変異株をスクリーニングし、これまでに候補変異株3種分離した。現在、このミュータントタンパク質を精製し、実際に試験管内でSwi5-Sfr1による活性化がおこらないかどうか、もしそうであれば、Rad55-Rad57によっては活性化されるかどうかなど、生化学的な解析を行なっている。また、Sfr1の機能ドメインマッピングを行い、DNA結合部位、Rad51結合部位を同定した。Rad55-Raad57ヘテロ2量体によるRad51の活性化機構の解析においては、これまで長期間の懸案であった、Rad55-Rad57ヘテロ二量体の発現精製に成功した。今後、Rad55-Rad57によるRad51依存的DNA鎖交換反応の促進効果を解析する。
(3) 中・後期過程の解析：Fbh1 ヘリケースによる組換え中間体のプロセッシング機構について、新たに、正負の２面の効果を発見した。
(4) ヒトRad51活性化機構の解析：ヒトRad51の精製方法を改良して安定供給を可能とした。また、ヒトSwi5及びヒトSfr1の発現系を構築した。Brca2の発現精製系を検討し、改良しているところである。
以上の成果は、おおむね順調に進展していると評価される。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1) 初期過程の再構成系の構築と反応機構解析: Mre11, Rad50, Nbs1, Ctp1からなるMRNC複合体を再構築する。これを用いて、Mre11やCtp1のエンドヌクレアーゼ活性の制御機構を詳細に解析し、recombinogenic な3’突出型ssDNA単鎖DNAが生成される分子機構を明らかにする。特に、Mre11のエクソヌクレアーゼの方向性では3’突出型ssDNAの生成機構を説明できず、大きな問題となっている点に注目して解析する。また、MRNCタンパク質複合体に加えて、Rqh1 ヘリカーゼを追加して、end-resectionの反応を再構成する。
(2) 初期－中期過程、及び、中・後期過程の再構成系とその反応機構解析：Rad55-Raad57ヘテロ2量体による野生型Rad51の活性化機構をin vitroで詳細に解析する。また、Sfr1と遺伝学的相互作用がなくなったRad51ミュータントタンパク質を精製し、Swi5-Sfr1やRad55-Rad57による活性化制御反応について解析する。また、様々な観点から作成したRad51ミュータントを精製し、その生化学的特徴を解析する。Fbh1 ヘリケースによる組換え中間体のプロセッシング機構について、ヘリケースデッド変異体などを用いて、さらに詳細な解析を進める。また、いくつかのユビキチン化標的分子について、変異株を作成して、in vivo 機能を明らかにする。
(3) ヒトRad51の付随因子による活性化機構：ヒトRad51によるDNA鎖交換反応系を構築して、ヒトSwi5-Sfr1複合体がどのように作用するか、in vitroで解析する。さらに、Brca2については、安定的に多量生産・精製系を引き続き検討する。
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[Journal Article] Mechanistic insights into the activation of Rad51-mediated strand exchange from the structure of a recombination activator, the Swi5-Sfr1 complex.2012
Author(s)
Kuwabara N, Murayama Y, Hashimoto H, Kokabu Y, Ikeguchi M, Sato M, Mayanagi K, Tsutsui Y, Iwasaki H, Shimizu T.
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Journal Title
Structure
Volume: 20
Pages: 440-449
DOI
Peer Reviewed
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