2014 Fiscal Year Annual Research Report
試験管内再構成系を用いた相同組換え反応における時空間ダイナミズムの分子機構研究
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24247033
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
岩崎 博史 東京工業大学, 生命理工学研究科, 教授 (60232659)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 相同組換え / DNA二重鎖切断 / DNA修復 / DNA鎖交換反応 / 分裂酵母 / Fbh1 / Ctp1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
相同組換え (修復) は、大きく３ つの反応ステップ（初・中・後期） に分かれるが、本申請研究では、分裂酵母を主要な生物モデル系として、申請代表者らによって独自に発見された因子（Nbs1、Nip1/Ctp1、Swi5-Sfr1 複合体、 Fbh1 ヘリケースなど） を中心に、各ステップを再構成し、これらの因子がそれぞれの反応過程にどのように関与するのか分子レベルでの解明、また、一部は、ヒトタンパク質ホモログを解析し、その普遍性の検討、さらに、各ステップ間を再構成し、ステップ間の連携機構の解明、最終的に、これらのアプローチより、時空間的にダイナミックな核内反応機構における分子反応機構解析のパラダイムの構築を目指している。
2014年度は、Fbh1ヘリカーゼの解析ついて大きな成果があった。すなわち、1) 遺伝学的な解析から、Fbh1はmitoticな相同組換え修復において、交差型組換えを負に制御すること、2) 生化学解析から、Rad51依存的なDNA鎖交換反応に対して、負の制御をすること、3) 試験管内反応系で、ユビキチンリガーゼE3として機能することなどを纏めて、論文発表した。
また、Rad51リコンビナーゼの活性化因子であるSwi5-Sfr1複合体がRad51と相互作用するのに重要な働きをしているアミノ酸残基を同定する目的で、Rad51の表面に位置すると予想されるアミノ酸残基のアラニンスキャニングを行った。その結果、数カ所の候補残基を同定することができた。
さらに、Mre11-Rad50-Nbs1複合体を相互作用するCtp1のプロテアーゼ限定分解を行い、C末端の機能ドメインを同定した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1)初期過程の再構成系の構築と反応機構解析:初期過程には、Mre11, Rad50, Nbs1, Ctp1などが関与する。昨年度までに、プロテアーゼ限定分解を行いCtp1のドメインを同定した。そして、Ｃ末端に特異的なモチーフを見出し、現在、このドメインの結晶化を図っている。2015年度は、引き続き、Ctp1Ｃ末端のの結晶化を行い、立体構造を決定する予定である。
(2)初期－中期過程の再構成系を用いた反応機構解析：Rad51が一本鎖DNAに結合して形成するフィラメントを、蛍光異方性を利用して解析する手法を立ち上げた。これを利用して、Swi5-Sfr1によるRad51ヌクレオプロテインフィラメントに対する影響を解析した。その結果、Swi5-Sfr1による安定化はRad51の解離速度の低下を促すことが原因であることを明らかにした。Swi5-Sfr1が存在しない時と比べて極めて高い安定化（５０倍程度）であることが分かった。また、Rad51と相互作用するのに重要な働きをしているアミノ酸残基を同定する目的で、Rad51の表面に位置すると予想されるアミノ酸残基のアラニンスキャニングを行った。その結果、数カ所の候補残基を同定することができた。現在、このRad51変異蛋白質を精製して、生化学的解析を開始したところである。
これらの成果は、当初研究目的と照らし合わせて、概ね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1) 初期過程の再構成系の構築と反応機構解析: 引き続き、これまでの解析を継続して行う。すなわち、以下の実験を継続遂行する。Mre11, Rad50, Nbs1, Ctp1からなるMRNC複合体を再構築する。また、Ctpタンパク質のＣ末端ドメインの結晶化を成功させ、X線立体構造を決定する。
(2) 初期－中期過程、及び、中・後期過程の再構成系とその反応機構解析：これまでの様々なトライアルから、Rad55-Rad57の多量発現系は、結局、分裂酵母を利用して解析することが最も有効であると結論した。2015年度は、この系に注力する。精製が完了したなら、Rad55-Rad57ヘテロ2量体による野生型Rad51の活性化機構のin vitro解析を重点化する。また、Swi5-Sfr1に関しては、生物物理学的手法を導入して、Rad51フィラメントの安定化を解析する。特に、ATPの効果について、徹底的に解析する。また、Swi5-Sfr1複合体との相互作用ができなくなったRad51蛋白質について、精製したタンパク質標品を用いてを生化学的に徹底して行う。最終年度であるので、以上を纏めて、論文発表する。
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