2012 Fiscal Year Annual Research Report
多機能型担子菌による統合木質バイオリファイナリープロセスの構築
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24248030
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Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
近藤 隆一郎 九州大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (80091370)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
平井 浩文 静岡大学, 農学部, 准教授 (70322138)
山岸 賢治 東北農業研究センター環境保全型農業研究領域, その他部局等, 主任研究員 (80355304)
亀井 一郎 宮崎大学, 農学部, 准教授 (90526526)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 木質バイオリファイナリー / バイオエタノール / 脱リグニン / 木質バイオマス / 広葉樹 / 針葉樹 / 白色腐朽菌 / 褐色腐朽菌 |
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| Research Abstract |
木材腐朽菌のリグニン分解能を強化することを目的とした。モデル微生物としてPhanerochaete sordida YK-624株を用いて、本菌の有するglyoxal oxidase遺伝子のクローニングを行い、高発現プラスミドを構築した。本菌に遺伝子を導入した結果、野生株より高いリグニン分解特性を示した。
Phlebia sp. MG-60の形質転換系確立を目指して、ハイグロマイシン遺伝子発現ベクターおよび EGFP 遺伝子発現ベクターを構築し、MG-60 株にプロトプラスト法で導入したところ、ハイグロマイシン耐性クローンが得られ、EGFP 遺伝子発現が確認できたクローンからは、緑色の蛍光が確認された。したがって、MG-60 発現ベクターおよび形質転換系が構築された。同様の方法で、MG-MnP2発現ベクターをMG-60 株に導入し、Kirk-HCHN 培地中のMnP 活性を測定したところ、野生株では MnP 活性が認められなかったのに対し、MnP 2 強制発現株においては強いMnP活性が認められたことから、リグニン分解酵素の強制発現株の取得も可能となった。
キチリメンタケKU-41株の安定的な遺伝子導入系を構築し、一度の操作で容易に数十～数百の遺伝子導入クローンを得ることが可能になった。YK-624株由来のリグニン分解酵素(YK-MnP)発現を試みたところRNAの強い発現が確認できたが液体培養液中のリグニン分解酵素活性は弱かった。一方、KU-41株自身のラッカーゼを構成的プロモーターに結合してhomologous expressionを行わせたところ、親株自身は全くラッカーゼ活性を示さないのと対照的に複数の遺伝子導入株で強い活性が確認された。褐色腐朽菌に恒常的なラッカーゼ発現能を持たせたのは本系が始めてである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究は、化学成分比・構造が異なる広葉樹及び針葉樹材に対応するIFFP（多機能型担子菌による統合木質バイオリファイナリープロセス（Integrated Fungal Fermentation Process））技術の確立を目的としている。
広葉樹材にはPhlebia sp. MG-60株を、針葉樹材にはキチリメンタケKU-41株を用いて、分子育種を用いた効率的なIFFP確立のための検討を行った。その結果、両菌ともに、ほぼ計画通りの進展が認められた。
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| Strategy for Future Research Activity |
Phlebia sp. MG-60株は木質バイオマスからのエタノール生産について、多くの利点があるものの、さらに発酵効率を高め、反応速度を高めるためには分子育種を必要とする。発酵反応の律速と予想される多糖分解酵素の高発現をターゲットとした分子育種を進める。当グループではすでに土壌環境より構築されたメタゲノムライブラリーより、木材の糖化に対して高活性なセルラーゼ、キシラナーゼ遺伝子を複数取得しているため、多糖の加水分解に対する分子育種の挿入遺伝子は複数保 持している。また、24 年度にクローニングした酵素遺伝子を、遺－課題１で構築した発現ベクターに連結し、Phlebia sp. MG-60株での発現を行う。また、プロセス全体の律速となりうるリグニン分解に対してもPhlebia sp. MG-60株のリグニン分解能向上に向けた分子育種を行うと共に、当グループがすでに超高活性リグニン分解菌として育種したPhanerochaete sordida YK-624株による脱リグニン処理とのコンビネーションによる強化を図る。
酵素糖化効率に影響を与えると予測した酵素遺伝子および発酵関連遺伝子を導入、強化したキチリメンタケ変異株の作出を行う。また、既にリグニン分解酵素系がクローニングされているP. sordida YK-624株由来のリグニン分解酵素系のキチリメンタケへの導入も試みる。まず、アルコール醗酵系の組換えを試み、その後他遺伝子の組み換えを行う。アルコール発酵性キチリメンタケの作出以降の変異株の評価は、アルコール発酵能により判断する。
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