栄養膜幹細胞におけるリプログラミング因子ＬＩＮ２８Ａの機能解析

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 24248048
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 田中 智 東京大学, 農学生命科学研究科, 准教授 (90242164)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 栄養膜幹細胞 / ＬＩＮ２８Ａ / ＲＮＡ結合タンパク質

Outline of Annual Research Achievements

マウス栄養膜幹細胞（TS細胞）において、RNA結合タンパク質であるLIN28Aは未分化時特異的に発現するが、そのパラログであるLIN28Bはほとんど発現していない。LIN28AとLIN28Bの発現は胚性幹細胞（ES細胞）でも認められるが、LIN28Bが発現していないTS細胞における、LIN28Aの生理的機能は特に興味深い。
本年度はまず、抗LIN28A抗体を用いたRNA免疫沈降（RIP）を行い、得られたRNAの配列を大規模シークエンスにより網羅的に決定した。その結果、LIN28A-RNA複合体には様々なmRNAが含まれること、また、そのmRNAの種類は、既報にあるES細胞におけるLIN28A-RNA複合体に含まれるものとは異なることが示された。すなわち、LIN28Aは両幹細胞で共通の標的RNAを持つのではなく、細胞種特異的に標的となるRNAを変えていることが示唆された。LIN28Aの発現操作がこれらのmRNA、および、TS細胞マーカー遺伝子の発現に与える影響を知るために、昨年度樹立したLIN28A発現抑制TS細胞株１ラインにおける遺伝子発現を解析した。すると、このラインにおいては、TS細胞の未分化マーカーであるCdx2の発現が、ｍRNAレベル、およびタンパクレベルの両方で有意に低下していた。しかし、分化マーカー遺伝子の発現は有意に上昇しておらず、未分化状態の破綻は起こっていないものと思われる。この結果は、TS細胞ではLIN28AがCdx2の発現量の安定化に寄与していること、しかしそれは必ずしもTS細胞の未分化状態の維持には必須ではないことを示唆する。
一方、LIN28A強制発現株は、本年度中（および、繰越後の平成26年7月まで）の樹立には至らなかった。LIN28Aの強制発現がTS細胞の維持を阻害する可能性も想定される。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

抗LIN28A抗体を用いたRIP-seqによる、LIN28A結合RNAの候補となるmRNAの網羅的同定は、予定通りの進捗を見た。しかし、LIN28Aを強制発現させた安定形質転換株が得られておらず、LIN28Aを過剰発現させた場合のLIN28A結合RNA 、あるいはその産物タンパク質の発現変化の解析をすることができていない。一方、LIN28A mRNAに対するshRNAを恒常的に発現させたLIN28AノックダウンTS細胞株は樹立することができたが、十分なノックダウン効果が認められる株は１ラインのみで、解析結果の信頼性を確保できていない。

Strategy for Future Research Activity

LIN28A mRNAに対するshRNAを恒常的に発現させたLIN28AノックダウンTS細胞株の追加樹立を優先して進め、最低でも３ラインを用いた解析を行う。これにより、突発的なライン特異的な現象と、LIN28Aの発現抑制によって引き起こされる現象との区別を可能とする。更に、これらのノックダウン株のトランスクリプトーム解析、および、分化誘導実験を行い、LIN28Aの発現抑制による表現型を解析し、TS細胞におけるLIN28Aの生理的機能を明らかにする。