ヒト神経芽腫ＭＹＣＮ／ＮＣＹＭマウスモデル構築による大規模分子標的創薬

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 24249061
• Research Institution: Chiba Cancer Center (Research Institute)
• Principal Investigator: 中川原 章 千葉県がんセンター(研究所), 研究所, 病院長 (50117181)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 大平 美紀 千葉県がんセンター(研究所), がんゲノム研究室, 室長 (20311384) ; 高取 敦志 千葉県がんセンター(研究所), 小児がん研究センター, 研究員 (40455390) ; 中村 洋子 千葉県がんセンター(研究所), がん先進治療開発研究室, 主席研究員 (60260254) ; 末永 雄介 千葉県がんセンター(研究所), がん先進治療開発研究室, 研究員 (80581793)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 神経芽腫 / TrkB / ALK / ShcC / 創薬

Research Abstract

小児がんの治癒率が７０％を越す中、今なお最も難治性の高リスク神経芽腫に対する新しい治療薬の開発は喫緊の課題である。インシリコ・オートドック・スクリーニング法を用いて、TrkB受容体のBDNF結合領域を標的とする３００万個の低分子化合物から、７個の阻害剤を同定し、IC-50の低い２個の構造から新規化合物の作製を試みた。その結果、さらにIC-50の低い化合物を見いだした。また、BDNFによるTrkBの活性化がこれらの化合物により強く抑制された。ALKとShcCが結合する領域２か所に結合する低分子化合物に関しては、下流で活性化されるシグナルの解析を進めた。
一方、神経芽腫cDNAプロジェクトから同定した高リスク神経芽腫に高発現するNLRR1新規膜蛋白質に対する単クローン抗体の中から神経芽腫細胞の増殖を抑制するものを選択し、エピトープマッピングを行った。また、抗がん剤との併用により相乗効果が認められた。
MYCNオンコジンの cis-antisense geneであるNCYM遺伝子は、ヒトおよびチンパンジーのみにしか無い蛋白質であることを明らかにしたが、MYCN蛋白質の安定化を起こす機序はGSK3bを阻害することによるものであることが明らかになった。NCYMトランスジェニックマウスを作成し、既存のMYCNトランスジェニックマウスとのダブルトランスジェニックマウスを作成したところ、ヒト神経芽腫に類似した遠隔転移を高頻度に起こした。発生した神経芽腫組織を収集し、現在、ヒト神経芽腫サブタイプとの比較をアレイCGHや次世代シーケンサーを用いて行なっている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

神経芽腫の標的分子に対する低分子化合物のスクリーニングと機能解析は、予定どおりTrkB、ALK、ShcCを対象に順調に進んでおり、３００万個の中から同定した阻害剤候補に関しては、アポトーシス誘導の下流シグナルの解析が進んだ。
神経芽腫細胞の増殖に抑制的に働くNLRR1単クローン抗体の同定も確実なものになり、安定した抑制効果が得られている。in vitroの研究からin vivo研究への移行を行うための抗体の大量作製も進み、一方でヒト化の試みも行っている。研究全体の計画はほぼ順調である。
上記のオリジナルな新薬候補の効果をスクリーニングするために、NCYM/MYCNダブルトランスジェニックマウスの継続的作成と、ゼノグラフトを用いた抗がん剤スクリーニング系の安定した供給を目指して体制作りを行った。時間がかかっているが、少しずつ進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

同定した低分子化合物の神経芽腫細胞増殖阻害剤としての細胞内シグナル伝達機構の解析をさらに進める。また、他の抗がん剤との併用効果に関しても、in vitroの系において研究を進め、臨床応用への道を探る。
NLRR1抗体に関しては、NLRR1との結合部位が明らかになったので、ヒト化抗体の作製を試みる。また、NLRR1が膜貫通領域において切断され、可溶性フラグメントができている可能性をさらに追究し、その確認と臨床的・生理学的意義について解析する。
NCYM蛋白質の機能的意義に関して研究し、とくにstemnessやcancer stem cellにおける役割について解析を進める。NCYM/MYCNダブルトランスジェニックマウスに発生した神経芽腫とMYCNトランスジェニックマウスに発生した神経芽腫を比較し、遺伝子発現、ゲノム異常（アレイCGH）などを検討する。

Research Products

• [Journal Article] RUNX3 interacts with MYCN and facilitates protein degradation in neuroblastoma. (2014)
  • Author(s): Yu F, Gao W, Yokochi T, Suenaga Y, Ando K, Ohira M, Nakamura Y, Nakagawara A.
  • Journal Title: Oncogene Volume: 33(20) Pages: 2601-2609
  • DOI: 10.1038/onc.2013.221.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Flotillin-1 regulates oncogenic signaling in neuroblastoma cells by regulating ALK membrane association. (2014)
  • Author(s): Tomiyama A, Uekita T, Kamata R, Sasaki K, Takita J, Ohira M, Nakagawara A, Kitanaka C, Mori K, Yamaguchi H, Sakai R.
  • Journal Title: Cancer Res. Volume: 74(14) Pages: 3790-3801
  • DOI: 10.1158/0008-5472.CAN-14-0241.
  • Peer Reviewed / Open Access
• [Journal Article] Two cases of neuroblastoma comprising two distinct clones. (2014)
  • Author(s): Yamazaki F, Nakazawa A, Osumi T, Shimojima N, Tanaka T, Nakagawara A, Shimada H.
  • Journal Title: Pediatr. Blood Cancer Volume: 61 Pages: 760-762
  • DOI: 10.1002/pbc.24779
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] NCYM, a Cis-Antisense Gene of MYCN, Encodes a De Novo Evolved Protein that Inhibits GSK3b Resulting in the Stabilization of MYCN in Human Neuroblastomas. (2014)
  • Author(s): Suenaga Y, S. M. Rafiqul Islam, Jennifer Alagu, Kaneko Y, Kato M, Tanaka Y, Kawana H, Hossain S, Matsumoto D, Yamamoto M, Shoji W, Itami M, Shibata T, Nakamura Y, Ohira M, Haraguchi S, Takatori A, Nakagawara A.
  • Journal Title: PLoS Genet. Volume: 10 Pages: e1003996
  • DOI: 10.1371/journal.pgen.1003996
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Identification of novel candidate compounds targeting TrkB to induce apoptosis in neuroblastoma. (2014)
  • Author(s): Nakamura Y, Suganami A, Fukuda M, Md. Kamrul Hasan, Yokochi T, Takatori A, Satoh S, Hoshino T, Tamura Y, Nakagawara A.
  • Journal Title: Cancer Medcine Volume: 3 Pages: 25-35
  • DOI: 10.1002/cam4.175
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Neuroblastoma in older children, adolescents and young adults. A report from the International Neuroblastoma Risk Group Project. (2014)
  • Author(s): Mosse YP, Deyell RJ, Berthold F, Nakagawara A, Ambros PF, Monclair T, Cohn SL, Pearson AD, London WB, Matthay KK.
  • Journal Title: Pediatr. Blood Cancer Volume: 61 Pages: 627-635
  • DOI: 10.1002/pbc.24777
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Novel 1p tumor suppressor DMAP1 regulates MYCN/ATM/p53 pathway. (2014)
  • Author(s): Yamaguchi Y, Takenobu H, Ohira M, Nakazawa A, Yoshida S, Akita N, Shimozato O, Iwama A, Nakagawara A, Kamijo T.
  • Journal Title: Eur. J. Cancer Volume: 50 Pages: 1555-1565
  • DOI: 10.1016/j.ejca.2014.01.023
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] RASSF1A methylation may have two biological roles in neuroblastoma tumorigenesis depending on the ploidy status and age of patients. (2014)
  • Author(s): Haruta M, Kamijo T, Nakagawara A, Kaneko Y.
  • Journal Title: Cancer Lett. Volume: 348 Pages: 167-176
  • DOI: 10.1016/j.canlet.2014.03.022
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Metastatic Neuroblastoma Confined to Distant Lymph Nodes (stage 4N) Predicts Outcome in Patients With Stage 4 Disease: A Study From the International Neuroblastoma Risk Group Database. (2014)
  • Author(s): Morgenstern DA, London WB, Stephens D, Volchenboum SL, Hero B, Di Cataldo A, Nakagawara A, Shimada H, Ambros PF, Matthay KK, Cohn SL, Pearson AD, Irwin MS.
  • Journal Title: J. Clin. Oncol. Volume: 32 Pages: 1228-1235
  • DOI: 10.1200/JCO.2013.53.6342
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Krüppel-like factor 4 (KLF4) suppresses neuroblastoma cell growth and determines non-tumorigenic lineage differentiation. (2013)
  • Author(s): Shum CK, Lau ST, Tsoi LL, Chan LK, Yam JW, Ohira M, Nakagawara A, Tam PK, Ngan ES.
  • Journal Title: Oncogene Volume: 32 Pages: 4086-4099
  • DOI: 10.1038/onc.2012.437
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Cell culture and Drosophila model systems define three classes of anaplastic lymphoma kinase mutations in neuroblastoma. (2013)
  • Author(s): Chand D, Yamazaki Y, Ruuth K, Schönherr C, Martinsson T, Kogner P, Attiyeh EF, Maris J, Morozova O, Marra MA, Ohira M, Nakagawara A, Sandström PE, Palmer R, Hallberg B.
  • Journal Title: Dis. Model. Mech. Volume: 6 Pages: 373-382
  • DOI: 10.1242/dmm.010348
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Epithelial-mesenchymal transition-related gene expression as a new prognostic marker for neuroblastoma. (2013)
  • Author(s): Nozato M, Kaneko S, Nakagawara A, Komuro H.
  • Journal Title: Int. J. Oncol. Volume: 42 Pages: 134-140
  • DOI: 10.3892/ijo.2012.1684
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] A MYCN-amplified cell line derived from a long-term event-free survivor among our sixteen established neuroblastoma cell lines. (2013)
  • Author(s): Sugimoto T, Gotoh T, Yagyu S, Kuroda H, Iehara T, Hosoi H, Ohta S, Ohira M, Nakagawara A.
  • Journal Title: Cancer Lett. Volume: 331 Pages: 115-121
  • DOI: 10.1016/j.canlet.2012.12.011
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Novel adaptor protein Shf interacts with ALK receptor and negatively regulates its downstream signals in neuroblastoma. (2013)
  • Author(s): Takagi D, Tatsumi Y, Yokochi T, Takatori A, Ohira M, Kamijo T, Kondo S, Fujii Y, Nakagawara A.
  • Journal Title: Cancer Sci. Volume: 104 Pages: 563-572
  • DOI: 10.1111/cas.12115
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Temozolomide suppresses MYC via activation of TAp63 to inhibit progression of human glioblastoma. (2013)
  • Author(s): Yamaki T, Suenaga Y, Iuchi T, Alagu J, Takatori A, Itami M, Araki A, Ohira M, Inoue M, Kageyama H, Yokoi S, Saeki N, Nakagawara A.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 3 Pages: 1160
  • DOI: 10.1038/srep01160
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Stronger Prognostic Power of the CpG Island Methylator Phenotype than Methylation of Individual Genes in Neuroblastomas (2013)
  • Author(s): Asada K, Watanabe N, Nakamura Y, Ohira M, Westermann F, Schwab M, Nakagawara A, Ushijima T.
  • Journal Title: Jpn. J. Clin. Oncol. Volume: 43 Pages: 641-645
  • DOI: 10.1093/jjco/hyt058
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Apoptotic cell death in neuroblastoma. (2013)
  • Author(s): Li Y, Nakagawara A.
  • Journal Title: Cells Volume: 2 Pages: 432-459
  • DOI: 10.3390/cells2020432
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Dependence receptor UNC5D mediates nerve growth factor depletion-induced neruoblastoma regression. (2013)
  • Author(s): Zhu Y, Li Y, Haraguchi S, Yu M, Ohira M, Ozaki T, Nakagawa A, Ushijima T, Isogai E, Koseki HNakamura Y, Kong C, Mehlen P, Arakawa H, Nakagawara A.
  • Journal Title: J. Clin. Invest. Volume: 123 Pages: 2935-2947
  • DOI: 10.1172/JCI65988
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] ALK is a MYCN target gene and regulates cell migration and invasion in neuroblastoma. (2013)
  • Author(s): Hasan MK, Nafady A, Takatori A, Kishida S, Ohira M, Suenaga Y, Hossain S, Akter J, Ogura A, Nakamura Y, Kadomatsu K, Nakagawara A.
  • Journal Title: Sci. Rep. Volume: 3 Pages: 3450
  • DOI: 10.1038/srep03450
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] NFBD1/MDC1 Is Phosphorylated by PLK1 and Controls G2/M Transition through the Regulation of a TOPOIIα-Mediated Decatenation Checkpoint. (2013)
  • Author(s): Ando K, Ozaki T, Hirota T, Nakagawara A.
  • Journal Title: PLoS One. Volume: 8 Pages: e82744
  • DOI: 10.1371/journal.pone.0082744
  • Peer Reviewed