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2013 Fiscal Year Annual Research Report

フマル酸による翻訳後修飾の抑制を指標とした最適な栄養バランスの検討

Research Project

Project/Area Number 24300260
Research InstitutionTokai University

Principal Investigator

永井 竜児  東海大学, 農学部, 准教授 (20315295)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 藤原 章雄  熊本大学, 生命科学研究部, 助教 (70452886)
荒木 朋洋  東海大学, 農学部, 教授 (20193071)
Project Period (FY) 2012-04-01 – 2015-03-31
Keywordsメタボリックシンドローム / 脂肪細胞 / 翻訳後修飾
Research Abstract

我々は、脂肪細胞が高血糖状態に曝されると、TCAサイクルの中間体であるフマル酸の細胞内濃度が上昇し、フマル酸が蛋白と反応してS-(2-succinyl)cysteine (2SC)が生成すること、さらに本反応によってアディポネクチンをはじめ様々な細胞内蛋白の機能が低下する新規な翻訳後修飾経路を見いだしており、今回、脂肪細胞において2SC生成が促進するメカニズムを解明し、栄養学的観点から2SC生成を抑制するのに最適な食事の摂取バランスおよび摂食タイミング等を検討することを目的としている。
今年度の研究により、タンデム質量分析装置(LC-MS/MS)による血清中2SCの絶対的定量に必須である13C標識された内部標準用2SCの合成に成功した。血清中2SCの測定は、血清を分子量3000のカットオフフィルターで低分子量画分を得ることで測定が可能となった。そこで、健常及び糖尿病を誘発したラットの血清中2SCを比較したが、顕著な違いは認められなかった。現在、組織中2SC含量の比較を行っている。
脂肪細胞中2SCの測定は、脂肪酸や様々な夾雑物によってイオンサプレッションの現象がおこり、内部標準を含む2SCの測定感度が著しく低下した。対応策として、細胞蛋白0.1 mgを6N塩酸で加水分解後に塩酸を乾固し、陽イオン交換カラムであるStrata-X-Cカラムを用いて夾雑物を低減した結果、2SCのシグナルが検出可能となった。実際、未分化
3T3-L1細胞に比較して、脂肪細胞に分化した細胞では2SC含量が高値を示し、脂肪細胞をフマル酸共存下で培養するとさらに2SC含量が上昇することがLC-MS/MSで確認された。
また、今年度の研究により、抗原の合成法を改良して新たにモノクローナル抗2SC抗体が得られている。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

今年度の研究により、13C標識された内部標準用2SCが合成され、LC-MS/MSによる血清中2SCの正確な定量が可能となったことから、生体中2SCの定量については大きく前進したと考えている。また、この定量法により、疾患動物における血清中及び組織中2SC量の比較測定も進行中である。脂肪細胞中2SCの測定は、中性脂肪含量が高いことが影響してか血清中2SC測定法と異なり、測定法の確立に時間を要した。現在、陽イオン交換カラムを用いた前処理法によって脂肪細胞中2SCの測定が可能となったが、細胞中2SC含量を増加させる因子はフマル酸しか確認されていない。
また、フマル酸と還元処理したウシ血清アルブミン(BSA)を保温して、2SCが生成したウシ血清アルブミン(以下2SC-BSA)の調製に成功した。本2SC-BSAを抗原として新たにモノクローナル抗体が得られた。本抗体はウェスタンブロッティングにも利用可能であることが確認されており、次年度、予定通り血清中2SCの測定系確立に用いる予定である。
「フマル酸生成増加に関与する遺伝子の発現変動」については、LC-MS/MSによる2SC測定系をより安定したものにした上で、代謝に関連する酵素の活性、発現レベルを測定する予定であるため遅れが生じている。

Strategy for Future Research Activity

2SC定量に用いる13C-2SCの合成に成功したことから、生体試料中2SCの定量が可能となった。また、2013年度の研究結果より、ヒト血清に比較してマウス及びラットの血清中2SCは低値を示すことが明らかとなった。当初の予定ではラットに各種有機酸やアミノ酸含量の異なる飼料を摂取して生体2SCの変動を評価する予定だったが、今年度は如何なる食習慣で2SC値が増減するかを、ヒトを中心に評価することを計画している。具体的には、熊本大学医学部代謝内科及び、福岡大学医学部病理学教室と共同研究契約を結び、様々な生活習慣病患者の血清中2SC値を測定し、病態との関与を評価することを計画している。すでに両大学における倫理委員会の承認がおり、現在、血清及び動脈等の組織検体が集められている。
また、平成25年度に新たに得られたモノクローナル抗2SC抗体を用いて、血清中2SCの測定系を確立し、LC-MS/MS分析値との相関性を確認する。
具体的には、フマル酸と保温して2SCが生成したウシ血清アルブミン(2SC-BSA)をイムノプレートに固相化した後、ヒト血清サンプルと抗2SC抗体を同時に添加する。もし血清中に2SCが多ければ最終段階の発色が抑制される「競合ELISA」の原理を用いて、血清中2SCを免疫学的に定量する。96穴イムノプレートを用い、血清1検体に付2穴で測定することにより、イムノプレート1枚でおよそ45検体の血中2SC値が測定できる系を確立する。そして、LC-MS/MS分析値との相関性を評価し、高い相関性の得られる実験条件を検討する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

H25年度の実験計画で「フマル酸生成増加に関与する遺伝子の発現変動」について進める予定であったが、LC-MS/MSによる2SC測定系をより安定したものにした上で、着手することが最善と考え、来年度に着手することとしたため若干遅れが生じている。
当初予定していた「フマル酸生成増加に関与する遺伝子の発現変動」を検討する実験を来年度にすることとし、代謝に関連する酵素の活性、発現レベルを測定する試薬・器具を購入予定である。
また、次年度よりヒト介入試験に着手予定であり、LC-MS/MSによる血液中2SC測定のサンプル処理用カラム・フィルター・及び試薬等の購入を行う。
さらに血液中2SC化蛋白の迅速な検出法の確立のため、抗原抗体反応を用いた方法を予定しておりこの研究に用いる試薬・器具等の購入を行う。

  • Research Products

    (15 results)

All 2014 2013

All Journal Article (5 results) (of which Peer Reviewed: 5 results) Presentation (10 results) (of which Invited: 5 results)

  • [Journal Article] Inhibition of AGEs formation by natural products.2014

    • Author(s)
      Nagai R, Shirakawa JI, Ohno RI, Moroishi N, Nagai M.
    • Journal Title

      Amino Acids

      Volume: 46(2) Pages: 261-266

    • DOI

      10.1007/s00726-013-1487-z

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Ovalbumin modified with pyrraline, a Maillard reaction product, shows enhanced T-cell immunogenicity.2014

    • Author(s)
      (130) Heilmann M, Wellner A, Gadermaier G, Ilchmann A, Briza P, Krause M, Nagai R,Burgdorf S, Scheurer S, Vieths S, Henle T, Toda M.
    • Journal Title

      J Biol Chem.

      Volume: 289(11) Pages: 7919-7928

    • DOI

      10.1074/jbc.M113.523621

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Glyoxalase I reduces glycative and oxidative stress and prevents age-related endothelial dysfunction through modulation of endothelial nitric oxide synthase phosphorylation.2014

    • Author(s)
      Jo-Watanabe A, Ohse T, Nishimatsu H, Takahashi M, Ikeda Y, Wada T, Shirakawa J, Nagai R, Miyata T, Nagano T, Hirata Y, Inagi R, Nangaku M.
    • Journal Title

      Aging Cell

      Volume: Epub ahead of print Pages: in press

    • DOI

      doi: 10.1111/acel.12204

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Malondialdehyde and 4-hydroxynonenal adducts are not formed on cardiac ryanodine receptor (RyR2) and sarco(endo)plasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA2) in diabetes.2013

    • Author(s)
      Moore CJ, Shao CH, Nagai R, Kutty S, Singh J, Bidasee KR.
    • Journal Title

      Mol Cell Biochem.

      Volume: 376(1-2) Pages: 121-135

    • DOI

      10.1007/s11010-013-1558-1

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] The pentosidine concentration in human blood specimens is affected by heating.2013

    • Author(s)
      Nakano M, Kubota M, Owada S, Nagai R.
    • Journal Title

      Amino Acids

      Volume: 44(6) Pages: 1451-1456

    • DOI

      10.1007/s00726-011-1180-z

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Prevention of lifestyle-related diseases with natural compounds derived AGEs inhibitors.2013

    • Author(s)
      永井竜児、大野礼一、諸石成美、 白河潤一、永井美芽
    • Organizer
      第17 回アジア農業シンポジウム
    • Place of Presentation
      熊本 東海大学(熊本校舎)
    • Year and Date
      20131207-20131208
  • [Presentation] AGEs構造と病態との関連2013

    • Author(s)
      永井竜児、白河潤一、大野礼一、諸石成美、永井美芽
    • Organizer
      第23回日本メイラード学会
    • Place of Presentation
      大阪 ナレッジキャピタル コングレコンベンションセンター
    • Year and Date
      20131128-20131128
    • Invited
  • [Presentation] 運動における血中2SC量の変化2013

    • Author(s)
      白河潤一、品川雅敏、永井竜児
    • Organizer
      第23回日本メイラード学会
    • Place of Presentation
      大阪 ナレッジキャピタル コングレコンベンションセンター
    • Year and Date
      20131128-20131128
  • [Presentation] 糖質代謝:エネルギー産生と蛋白変性との関わり2013

    • Author(s)
      永井竜児
    • Organizer
      第37回鳥類内分泌研究会
    • Place of Presentation
      熊本 アソシエート
    • Year and Date
      20131121-20131121
    • Invited
  • [Presentation] AGEの測定について2013

    • Author(s)
      永井竜児
    • Organizer
      第2回川島腎カンファレンス
    • Place of Presentation
      岐阜 内藤記念くすり博物館
    • Year and Date
      20131026-20131026
    • Invited
  • [Presentation] 糖質と上手につきあってアンチエイジング2013

    • Author(s)
      永井竜児
    • Organizer
      第49回東海大学公開セミナーレッツ不思議
    • Place of Presentation
      熊本 東海大学(熊本校舎)
    • Year and Date
      20131005-20131005
    • Invited
  • [Presentation] LC-MS/MSを用いた脂肪細胞におけるTCA回路異常の検出とアディポネクチン分泌障害との関連2013

    • Author(s)
      永井竜児、白河潤一
    • Organizer
      第8回メタボロームシンポジウム
    • Place of Presentation
      福岡 九州大学医学部 百年講堂
    • Year and Date
      20131003-20131003
  • [Presentation] 脂肪細胞の新規ストレスマーカーである2SCの測定系の確立2013

    • Author(s)
      永井竜児、白河潤一、品川雅敏、多々良友博、有富美貴、佐藤瑛記、永井美芽、大和田滋
    • Organizer
      第86回日本生化学会大会
    • Place of Presentation
      横浜 パシフィコ横浜
    • Year and Date
      20130912-20130912
  • [Presentation] ミトコンドリアの新規ストレスマーカー2SCの測定意義2013

    • Author(s)
      永井竜児、白河潤一、品川雅敏、多々良友博、有富美貴、佐藤瑛記、永井美芽
    • Organizer
      第66回日本酸化ストレス学会
    • Place of Presentation
      名古屋 ウインクあいち
    • Year and Date
      20130613-20130614
    • Invited
  • [Presentation] 脂肪細胞におけるフマル酸由来翻訳後修飾物2SCの生成とその測定法2013

    • Author(s)
      品川雅敏、多々良友博、有富美貴、佐藤瑛記、白河潤一、永井美芽、永井竜児
    • Organizer
      第66回日本酸化ストレス学会
    • Place of Presentation
      名古屋 ウインクあいち
    • Year and Date
      20130613-20130614

URL: 

Published: 2015-05-28  

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