2013 Fiscal Year Annual Research Report
ライブセルイメージングによる遅延性小核誘導機構の解明
| Project/Area Number |
24310047
|
|---|
| Research Institution | Osaka Prefecture University |
|---|
Principal Investigator |
八木 孝司 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (80182301)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
児玉 靖司 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 教授 (00195744)
杉本 憲治 大阪府立大学, 生命環境科学研究科(系), 教授 (40196746)
川西 優喜 大阪府立大学, 理学(系)研究科(研究院), 助教 (70332963)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
|
| Keywords | ライブセルイメージング / 環境変異原 / 遅延性小核 / 小核試験 |
|---|
| Research Abstract |
小核誘導は国の遺伝毒性試験の１つに位置づけられている。近年、申請者らは新しいライブセルイメージング法により、変異原処理後の哺乳類細胞に誘導される小核は、最初の分裂時のみならず、正常分裂した後２回目・３回目の分裂時にも誘導されることを発見した（これを遅延性小核誘導とよぶ）。本研究の目的はこの現象を詳細に検討し、その機構を明らかにすることである。
本年度はHistone H3をmCherryで標識したCHO AA8細胞を用いて、UV（ピリミジンダイマーを形成）、コルヒチン（M期紡錘糸形成を阻害）の80%増殖阻害濃度において、UVは処理後最初の分裂で小核を多く誘導するが、コルヒチンは２回目の分裂で小核を多く誘導させることがわかった。コルヒチン処理では、細胞分裂時間も２回目まで影響を受けることがわかった。Histone H3をmCherryで標識したm5s細胞にX線照射し、一旦生成した小核が３回目以降の分裂時に再び細胞核に取り込まれ、これが染色体異常につながることを示した。また再取り込みが行なわれる小核のほとんどがセントロメアを持たない断片であることがわかった。多色標識した細胞ではMMC処理後の細胞死までの過程を、ミトコンドリア膜電位の変化、活性酸素誘導などで追跡できることを示した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
研究とは予定通り進むものではなく、研究結果に応じて適宜なすべき実験は異なる。しかしながら本研究の目的とすることは概ね順調に達成できている。その結果、25年度は多くの学会発表や論文発表をすることができた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
八木・児玉・川西は、変異原の作用機序により小核誘導が区別できるかどうか、X線、MNU、ビンブラスチンなどの濃度を変えて処理し、細胞分裂を72時間タイムラプス撮影して細胞系譜解析を行なう。さらに児玉はX線照射後の細胞分裂系譜がp53の発現有無によって違いがあるかどうか明らかにする。また継続して、X線による小核が染色体不分離によるか染色体切断によるかをセントロメアおよびテロメアFISH解析で明らかにする。杉本は、ミトコンドリア数の変化、ROS の発生、アポトーシスの割合をライブで追跡し頻度を求める。変異原の作用機序により細胞周期停止位置が区別できるかどうか、５種類の細胞内小器官を各５色の蛍光染色で調べる。
|
| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
申請額より交付額が減額されたため、ライブセルイメージング装置がレンタル不可能となった。当初レンタル予定していた装置が杉本教授の元で使用可能となったが、研究代表者の八木はその分は消耗品として利用し、一部は次年度に繰り越し、より有効に用いることとした。
26年度は概ね物品費221万円、旅費40万円、人件費・謝金230万円、その他費5万円を予定している。物品費はこれまでどおり高額な分子生物学のキット・酵素類、およびプラスチック小器具類などの消耗品の購入にあてる。最終年度であるため、イメージング解析等に研究補助者を雇用し、当初の目標を越える研究の達成を目指す。
|
