2014 Fiscal Year Annual Research Report
ＢＴ殺虫性タンパク質のエッセンスでタンパク質殺虫剤を創る
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24310054
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
佐藤 令一 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (30235428)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岩淵 喜久男 東京農工大学, (連合)農学研究科(研究院), 教授 (00203399)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 環境技術 / 環境材料 / 農薬 / Bacillus thuringiensis |
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| Outline of Annual Research Achievements |
１）今期はまず，進化分子工学を実施する対象ABCC2分子をどの昆虫由来のものにして，どのCry殺虫タンパク質を進化させることにするかを決めるべく検討した．まず，カイコ幼虫のABCC2，すなわちBmABCC2をバキュロウイルス発現系を使って昆虫培養細胞Sf9に発現させ，タグ精製法を用いて粗精製する方法を確立した．粗精製BmABCC2標品はBiacoreセンサーチップに固定化し，カイコ幼虫に効かないことが知られているCry3Aa型， Cry9Aa型と，微弱な殺虫活性を持つことが知られているCry8Ca型の各殺虫タンパク質がBmABCC2に対してどのような結合解離動態を示すかを計測した．結果，カイコ幼虫に全く効かない殺虫タンパク質はBmABCC2にまったく結合しなかったが，微弱な活性持つCry8Ca型殺虫タンパク質はわずかながら結合した．Cry殺虫タンパク質の進化分子工学は少しは結合する関係から出発する方が成功を導くことが容易であろうと考え，進化させる殺虫タンパク質はCry8Ca型殺虫タンパク質とし，その対象分子はカイコのBmABCC2と設定することとした．
２）次に，Cry8Ca型殺虫タンパク質のDNAに変異を入れてT7ファージに発現させて，選抜の対象とするCry8Ca型殺虫タンパク質変異体ライブラリーを作製した．ループ３部位に４アミノ酸連続でランダム変異を導入してT7ファージに発現させ，1.0e6個の変異体を含むライブラリーを調製した．
３）更に，「進化したCry8Caを選抜する方法」である「受容体に対するパニング選抜系」の構築に取り掛かった． BmABCC2を発現Sf9細胞から調製した膜画分を界面活性剤n-dodecyl-β-D-maltosideで可溶化して BmABCC2を粗精製した．粗精製BmABCC2をスチレンプレートにコーティングし，それをパニング用のプレートとし，このプレートがCry1Aa提示T7ファージを選択的に濃縮することができるかを検討した．結果，一回のパニングあたり５倍程Cry1Aa提示T7ファージの濃縮が確認された．
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| Research Progress Status |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Causes of Carryover |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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Research Products
(10 results)
