2012 Fiscal Year Annual Research Report
新規部位特異的組換えシステムを基にしたゲノムエンジニアリング・テクノロジーの開発
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24310143
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Kazusa DNA Research Institute |
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Principal Investigator |
中山 学 公益財団法人かずさDMA研究所, ヒトゲノム研究部, 主任研究員 (30370927)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 遺伝子 / ゲノム / 機能ゲノム / 動物 / 発生・分化 / バイオテクノロジー / 病態モデル動物 / 部位特異的組み換え |
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| Research Abstract |
部位特異的組み換えシステムであるCre/loxPやFlp/FRTシステムは、部位特異的にゲノムを改変することができる広く汎用されているテクノロジーであり、CreやFlp組み換え酵素依存的に34塩基の組み換えサイトに挟まれた領域を除去、反転することができる。とりわけマウスのコンデショナルKOの実験では、コアとなる技術でありCre/loxPがエクソン除去のために、Flp/FRTが(正常な発現を邪魔する可能性がある)薬剤耐性遺伝子の除去のために両者のシステムが同時に用いられている。我々はCre/loxPと認識サイトが異なり、同一細胞内で使用することができる新しい部位特異的組み換え酵素システム、VCre/VloxPとSCre/SloxPを開発した。これらのVCre/VloxPとSCre/SloxPシステムが実際にマウスで有用なツールとして使用できることを実証するために、VCreやSCre発現マウス、ならびにマウス内で組み換え反応が起きたことを検出するためのリポーターマウスを作製した。マウスの全組織で発現させるためにCAGプロモーターを用いたVCreとSCre発現トランスジェニックマウスだけでなく、タモキシフェンで誘導できるVCreERT2マウスも作製した。一方、レポーターマウスは、2個のVloxPサイトで挟まれたSTOPカセットがCAGプロモーターとEGFPの間に配置され、VCre/VloxP反応によってSTOPカセットが除かれてEGFPが発現するコンストラクトをROSA26遺伝子座にノックインさせることにより作製した。SCreレポーターマウスもSloxM1サイトと赤色蛍光蛋白質であるtdTomatoの組み合わせであることを除いて同様のタイプである。これらのマウスの解析を通して、より緻密で複雑なゲノム改変がマウス個体レベルで実現可能であることを明らかにしていく。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
TGマウスとHーマウス用のコンストラクトを計画通りに構築し、各マウスの作製及びにノックインES細胞のスクリーニングを計画通りに進めることができた。
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| Strategy for Future Research Activity |
TGマウスの組織内でのVCre蛋白質とSCre蛋白質の発現をウエスタン法等を用いて調べる予定である。更に新規ゲノム改変技術の開発を試みる。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
効率的な試薬等の使用と古い機器類の買い替えを控えたために当該助成金が生じた。次年度も引き続き、効率的な助成金の使用を行うとともに研究の更なる発展が得られるように計画的な使用を試みる。
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