2012 Fiscal Year Annual Research Report
クマリンのプレニル基転移酵素ファミリーの開拓と触媒機能の高次制御
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24310156
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
矢崎 一史 京都大学, 生存圏研究所, 教授 (00191099)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
杉山 暁史 京都大学, 生存圏研究所, 助教 (20598601)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | クマリン / プレニル基転移酵素 / 膜タンパク質 / プレニルジリン酸 |
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| Research Abstract |
プレニル化フラノクマリンを多量に含むレモンの外果皮から蛋白質を調製して酵素活性を調べ、その酵素の特性を明らかにした。この成果に関しては、論文としてまとめ、報告した(Munakata R. et al. 2012)。
レモンの外皮からクローニングした膜結合性プレニル基転移酵素cDNA(CIPT-1)をシャトルベクターpDR196にサブクローニングし、出芽酵母の形質転換と当研究室で確立した酵素アッセイ法を組み合わせ、CIPT-1がクマリンのプレニル化酵素であることを突き止めた。酵母で発現させたリコンビナント蛋白質を用いて基質特異性を調べた結果、CIPT-1はごく限られたクマリンのみをプレニルアクセプター基質とすること、その中ではウンベリフェロンを最も良い基質とすること、またプレニルドナー基質としては炭素数10のGPPに高い特異性を示すことを突き止めた。また二価カチオン要求性、至適pH、Km値など酵素化学的諸性質を明らかにし、フラボノイド特異的なSfN8DT1、SfG6DT等とよく類似した性質を持つ膜結合型酵素であることを明らかにした。
並行して、従前全くクローニング例のないO-プレニル化酵素を求め、現在グレープフルーツからプレニル化酵素遺伝子を5種類取得し、Nicotiana属植物の細胞をホストとする手法で酵素活性の検出を試みているところである。
膜結合型プレニル化酵素の分子進化を論じるため、柑橘類以外の植物ファミリーに遺伝子源を求め、フラノクマリンを多量に含むパセリから、クマリンを基質とするプレニル基転移酵素の候補遺伝子を取得している。これに関しては現在解析中である。
以上の研究の推進に当たり、新たに導入した汎用性の高いCCDイメージャーが効力を発揮し、順調な進捗を得ることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の目的であった、レモン内在性のプレニル化酵素に関する生化学的な解析は予定期間内に終了し、論文として発表することができた。また、最初のクマリン特異的なプレニル化酵素遺伝子のcDNAに関しては、基質特異性や酵素化学的な性質の解析も順調に終了し、現在論文を執筆中である。従前クローニング令の全くないO-プレニル化酵素に関しては、現在候補遺伝子の機能解析中である。研究の進捗に特に遅延はなく、ほぼ予定通りのペースで研究が進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
ほぼ予定通りに研究が進捗していることから、当初の研究計画所に沿った推進を行う予定である。若干の変更点としては、プレニル化酵素の基質や生産物特異性などを分子レベル論じるために、柑橘類以外の植物ファミリーからクマリン基質のプレニル化酵素をクローニングするべきであるとの観点から、パセリのプレニル基転移酵素の解〓を開始している。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
現在解析中の候補クローンの中から、O-プレニル化酵素が同定できれば、C-プレニル化酵素のアミノ酸配列との比較から、キメラ酵素、あるいは部位特異的突然変異などを導入して、生産物特異性を決定する分子メカニズムの解明を行う計画である。
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