2013 Fiscal Year Annual Research Report
ＲＮＡ分子の細胞内構造プローブ法開発と細胞質スプライシング機構解析
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24310163
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
田中 好幸 東北大学, 薬学研究科(研究院), 准教授 (70333797)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 生体分子計測 / NMR / 安定同位体標識 / バイオプローブ / 細胞内化学反応 |
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| Research Abstract |
本研究課題では細胞内におけるRNA分子の構造解析、及び、動態解析（代謝過程の経時観測等）を目指している。このような解析を行うためには、観測対象のRNA分子と対象ではない内在性RNA分子を識別する必要がある。これを実現するための戦略として、研究代表者は標的RNA分子を安定同位体標識することを計画している。なお生理活性を有したRNA分子の機能にかかわる配列は全配列中の一部であるため、機能性部位のみを標識することで機能構造解析および代謝過程の経時観測が可能となる。従って、本研究課題においてはRNA分子の特定部位のみを標識する手法の開発から着手した。そこで平成２４年度は、当研究室で開発した旧法の問題点を克服した任意の塩基を標識可能な新規標識法を検討した。検討の結果、RNA polymeraseのプライマー伸長反応（及び標識NTP）を鍵反応とする「RNA分子内の機能性配列の一塩基／部分標識法」の汎用的手法を確立した。
次に平成２５年度は、細胞質スプライシング切断反応を担う小胞体膜蛋白質Ire1p（RNaseドメイン）のRNA配列要求性について検証した。なおスプライシング基質のHAC1 mRNAの切断部位はループ構造をとると予想され、ループには保存配列（5' CXG/XXGX 3': /が切断部位）が存在する。本保存配列を元にした種々のRNA配列を調製し、in vitro切断実験にて配列要求性を解析した。その結果、1) 切断部位のGは必須であること、2) 切断部位Gの両脇に数塩基のRNA配列が必要であること、3) 長いRNA配列では切断部位G以外の保存配列であるC-Gが塩基対を組んだ時効率よく切断がおこることが示された。このように平成２５年度の研究により、細胞質スプライシング機構をIre1pの配列要求性（基質特異性）の観点、及び、基質HAC1 mRNAの二次構造の観点から明らかにすることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
計画では平成２５年度に「Ire1p RNaseドメインの基質RNA配列の要求性（基質特異性）を明らかにすること」を目指してきた。Ire1p-mRNA(HAC1)複合体の構造解析および細胞内におけるHAC1 mRNAのスプライシング過程を観測するためには、解析に適した配列を決定することが必須である。基質配列要求性はIre1p RNaseドメインとの複合体形成する配列候補そのものであり、生化学的（酵素学的）に意味のあるHAC1 mRNAの二次構造ユニット（配列）を抽出したことに相当する。同様に、本配列は細胞中でのHAC1 mRNAのプロセス過程をモニターするための最少ユニットとなる。細胞内導入を考えた際に、大きなRNA分子を導入するのは障壁が大きいが、小型化することで導入効率を上げやすくなる。従って、今年度達成された「Ire1p RNaseドメインの基質RNA配列の要求性を明らかにすること」は次年度に構造決定／細胞内動態解析を行うための重要なステップである。これが達成されることにより、次年度の研究が大きく加速されることが期待される。
さらに平成２４年度の研究で確立したRNA分子の部位特異的（一塩基）安定同位体標識法により、上記実験で決定されたRNA配列を標識することが可能である。具体的な標識部位としては、HAC1 mRNAの切断部位のループ中の保存配列（5' CXG/XXGX 3': /が切断部位）を一塩基ずつ標識することをが可能となっている。なお平成２５年度の実験で標識すべき部位と、各部位の保存理由（標識体で確認すべきこと）がはっきりとしたため、安定同位体として15N（塩基対形成プローブ用）をもちいるか13C（プロセス過程モニター用）を用いるかも確定した。従って平成２６年度は、15N/13C標識体を調製して、構造解析／動態解析（プロセス過程モニター）への移行準備が完了した。このように本研究課題はほぼ順調に進展している。
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| Strategy for Future Research Activity |
「現在までの達成度」のところで述べた通り、平成２４年度の研究で確立したRNA分子の部位特異的（一塩基）安定同位体標識法により、細胞質スプライシングの標的RNA配列を標識することが可能である。なお、平成２５年度の実験で、標的RNA配列の要求性、即ち、解析に用いるRNA配列の詳細が確定した。具体的な標識分子としては、HAC1 mRNAの切断部位のヘアピンループ配列となる。なお上述の一塩基標識法により、本ヘアピンループの保存配列（5' CXG/XXGX 3': /が切断部位）を一塩基ずつ標識することをが可能となっている。本保存配列中にはグアノシン残基が多く、かつ、グアノシンは標識法が最も行いやすい残基であるため、個々の残基を標識した標識サンプル調製が可能と考えられる。また本保存配列5'端のシトシン残基C1と3'端から2残基目のグアノシン残基G6についてはループ内塩基対形成をプローブする残基となる。一方の残基はグアノシンであり、確実な標識が可能である。また、シトシンの標識も全く問題なく進行する手法が平成２４年度に確立しているので、こちらの標識も全く問題ない。なお平成２５年度の実験で標識すべき部位と、これらの各残基の保存理由（標識体で確認すべきこと）が本研究により判明したため、各標識サンプルで用いる安定同位体（15N：塩基対形成プローブ用；13C：プロセス過程モニター用）も確定した。
従って、平成２６年度はループ内で塩基対形成していると考えられているC1-G6残基を独立に15N標識したRNA分子を調製し、溶液NMRにより塩基対形成の有無について検証する（構造解析への応用）。切断部位G残基を13C標識した分子では、Ire1p RNaseドメインによって切断されたRNA断片の切断部位のリン原子のシグナルを1H-13C-31P相関スペクトルを使って検出し、プロセス過程をモニターする。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
2012年度は残額が13,669円となり、年度末において常時使用する消耗品調達や想定外支出への対応ができるかを心配する状況であった。特に本研究課題の遂行に必須のDNA/RNA合成機の老朽化により2012年度末に想定外の大きな支出が出てしまった。2012年度は結果的にほぼ予算通りの執行となったが、予算に余裕がない状態で年度末を迎えると、機器修理等の想定外の支出により年度末の実験に支障が出るという経験をした。そこで今年度は年度当初より、消耗品の支出を押さえ気味にする方針で臨んだ。具体的には、１）予備実験を充実させて前年度よりもさらに厳格に必要最低限の試薬のみ購入する、２）大量に消費することが予め想定される試薬について一括で大量購入するなどの対応で値引率を上げて、トータルの支出を圧縮するということを行った。これらの自助努力によって年度末に予定外の修理等にも対応できるようにでき、結果的に今年度は残額が生じた。
最終年度に当たる2014年度はIre1pによるHAC1 mRNAの細胞質スプライシング機構についての最終的な実験を行う予定としている。それに当たり、HAC1 mRNA-Ire1pの系の共同研究者である児嶋長次郎准教授（阪大蛋白研）に研究分担者として加わって頂くこととした（分担金：100万円）。なお最終年度は、in cell NMR測定なども必要であり、児嶋准教授の所属される阪大蛋白研には全国共同利用施設である、生体分子測定に特化した高感度／最新鋭のNMR分光器が存在する。これらのNMR装置を利用する上でも、児嶋准教授との共同研究は重要である。また最終年度にあたる2014年度は、メカニズム解析用NMR測定／in cell NMR測定用に大量のRNAサンプル調製が必要となり、必要な消耗品予算を計上した。また、DNA/RNA合成機の修理費確保の目的で「その他」の費目を厚くした。残りは例年の出張費等の旅費支出額を考慮すると、当初予算をすべて執行するものと考えられる。
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Research Products
(14 results)
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[Journal Article] The structure of metallo-DNA with consecutive T-HgII-T base-pairs explains positive entropy for the metallo-base-pair formation2014
Author(s)
Hiroshi Yamaguchi, Jakub Sebera, Jiro Kondo, Shuji Oda, Tomoyuki Komuro, Takuya Kawamura, Takenori Daraku, Yoshinori Kondo, Itaru Okamoto, Akira Ono, Jaroslav V. Burda, Chojiro Kojima, Vladimir Sychrovsky, Yoshiyuki Tanaka
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Journal Title
Nucleic Acids Research
Volume: 42
Pages: 4094-4099
DOI
Peer Reviewed
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[Presentation] Structure of Ag(I)-mediated C-C base pair determined by hetero-nuclear NMR spectroscopy2013
Author(s)
Takenori Dairaku, Itaru Okamoto, Kyoko Furuita, Jukub Sebera, Mathias Bickelhaupt, Shuji Oda, Daichi Yamanaka, Yoshinori Kondo, Vladimir Sychrovsky, Chojiro Kojima, Akira Ono, ◯Yoshiyuki Tanaka
Organizer
40th International Symposium on Nucleic Acids Chemistry
Place of Presentation
横浜
Year and Date
20131113-20131115
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[Presentation] 水銀イオンのT-Tミスマッチ塩基対に対する親和性の構造化学的要因（口頭発表）2013
Author(s)
◯田中好幸, 大樂武範, 根東義則, 内山朋美, 三浦隆史, 竹内英夫, 古板恭子, 児嶋長次郎, Ladislav Benda, Jakub Sebera, Vladimir Sychrovsky, 岡本到, 小野晶
Organizer
第回 生体分子科学討論会
Place of Presentation
大阪
Year and Date
20130607-20130608
