2012 Fiscal Year Annual Research Report
酵素による糖質の炭素環化を基軸とする有機工業資源化グリーンケミストリー
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24350078
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
江口 正 東京工業大学, 大学院・理工学研究科, 教授 (60201365)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | グリーンケミストリー / 糖質 / 炭素環化 / 酵素変換 |
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| Research Abstract |
2-デオキシ-scyllo-イノソース(DOI)合成酵素は、グルコース-6-リン酸(G-6-P)を基質とし、NADを補酵素として、炭素6員環化合物、DOIへの変換反応を触媒する酵素である。DOIは簡単な化学反応で芳香環化し、有用工業資源であるカテコール等に変換可能である。すなわち、本酵素は再生可能資源の糖質から有機化学工業資源を生産する手段になり得ると考えられる。
DOI生産のためには、基質としてG-6-Pの供給が必要である。試験管内では、G-6-Pは、ATPの存在下、ヘキソキナーゼの作用により調製できるが、高価なATPを用いるため、実用に用いることができない。従って、微生物の代謝系を利用したG-6-Pの供給、すなわち発酵系によるDOI生産利用が考えられている。そこで、G-6-Pの供給法としてポリリン酸グルコキナーゼ(PPK)により調製を試みた。ポリリン酸グルコキナーゼは、安価なポリリン酸をリン酸供与源として、グルコースの6位を直接リン酸化する酵素である。PPKによるG-6-Pの供給が可能であれば、2つの酵素を利用した1ポットの反応で、DOI生産が可能となる。そこでまず鍵となるPPKの入手が必要であり、そのため入手容易でPPKの存在が予測可能であった放線菌Strepomyces coelicolorのPPK遺伝子のクローニングを行い、大腸菌での発現,酵素精製を行った。さらに精製したPPKとDOI合成酵素を用いてのDOI生成を検出したところ、予想通りDOIの生成が確認できた。また、PPKおよびDOI合成酵素を共にHis-tagタンパク質として発現させ、金属アフィニティーカラムを用いて、活性を保持したまま簡便に精製できることも確認した。さらに金属アフィニティー樹脂に保持した両酵素を用いてもポリリン酸およびNADの存在下でグルコースからDOIの生成も確認しており、酵素固定化による反応プロセスへの応用も可能であることが分かった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の本年度の計画であったポリリン酸グルコキナーゼのクローニング、発現および2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素と組み合わせての2-デオキシ-scyllo-イノソースの調製については、予定通り進行した。さらに2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素部位特異的変異についても計画に沿って進めている。以上のことを判断し、本研究は、おおむね順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、好熱菌由来のポリリン酸グルコキナーゼ遺伝子のクローニング、大腸菌での発現を行いより効率的な2-デオキシ-scyllo-イノソースの調製を目指す。さらにより効率的な2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素の取得を目指し、他の微生物起源の酵素を探索する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
効率的な2-デオキシ-scyllo-イノソース合成酵素の取得を目指し、他の微生物起源の酵素を探索するため、微生物の購入あるいは合成遺伝子の合成委託を計画したが、納期が間に合わないことが分かったので、その金額を次年度に繰り越した。次年度にこれらとその他の消耗品とに併せて使用する。
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