2012 Fiscal Year Annual Research Report
RNAの編集、化学修飾情報の1分子レベル解析技術の開発
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24350084
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
川井 清彦 大阪大学, 産業科学研究所, 准教授 (50314422)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 遺伝子診断 / RNA / エピジェネティクス / 1分子計測(SMD) / DNA |
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| Research Abstract |
RNAは転写後、アデニン(A)のイノシン(1)への編集、そしてシトシン(C)やAのメチル化(6mA)など、100種類以上の化学修飾を受けている。これらRNAのエピジェネティックな化学修飾は、様々な生命現象を制御していることが明らかになりつつあり、細胞内で発現している極微量のRNAから、そのエピジェネティックな化学修飾を検出・定量する新技術の開発が望まれている。極微量しか発現されないRNAの編集や化学修飾を解析するためには、通常cDNAへの逆転写、PCRによる情報増幅が不可欠となるが、多くのエピジェネティックな情報はこれら過程で失われてしまい、RNAの転写後の編集・化学修飾を解析することは困難であった。本研究課題では、ターゲットRNAを1分子レベルで解析し、極微量のRNAからエピジェネティックな情報を失うことなくそのまま迅速に読み出す新技術の開発を目指す。24年度の研究においては、より安価で取り扱いやすいDNAを用いて電荷移動可能な配列を拡張し、得られた系をRNA配列に適応することを試みた。人B型肝炎ウイルス(HBV)由来のDNA配列、および、HBV配列中の一塩基置換や一塩基欠損などの点変異を電荷移動速度の違いとして読み出す系の構築に成功した。このように新規に種々のDNA配列の読出しが可能になったが、当初計画していたDNA/DNA二本鎖における電荷移動測定が可能な配列の大幅な拡張は達成できなかった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
24年度の研究においては、より安価で取り扱いやすいDNAを用いて電荷移動可能な配列を拡張し、得られた系をRNA配列に適応することを試みたが、DNAIDNA二本鎖における電荷移動測定が可能な配列の大幅な拡張は達成できなかったため。
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| Strategy for Future Research Activity |
DNA/DNAの系で確認してからターゲットをRNAに変更するのではなく、ターゲットとして直RNAを用いて情報の読み出しを検討する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
まず、これまでDNA/DNAにおいて電荷移動測定を試みた配列、すなわちすでに保有している蛍光分子を修復したプローブDNAを用いて、RNAをターゲットとして電荷移動測定系を確立する。さらに、電荷分離収率が低いことが原因で測定が困難と判明した配列においては、天然塩基を種々のHOMO-levelを有する修飾塩基I、D、8-プロモグアニン(B)、デアザアデニン(ZA)などに置換し、HOMO-leve1が蛍光分子から正電荷アクセプターに向かい階段状に増加するように設計し、DNA内電荷移動の高速化を計る。一方、電荷再結合速度は、蛍光分子と正電荷アクセプター間の距離、および介在する塩基配列により決定される。現在のFCS装置では1 〓s以内に進行する電荷再結合過程はノイズが大きく測定が困難であり、また逆に寿命が長くなりすぎると、拡散成分との分離に困難を生じたり、正電荷や負電荷の不可逆的な反応によるプローブDNAの分解の確率を高めたりする恐れがある。FCS測定に適した時間領域で電荷移動が進行するよう配列を検討する。測定ではハイスループットな測定に優れたFCS装置(MF20)を用い、プローブDNA/ターゲットRNAの組み合わせを用いて、溶媒の粘度や酸素濃度(glycerinの添加)、蛍光分子の光退色を抑制する試薬(アスコルビン酸(ビタミンC誘導体)、Trolox(ビタミンE誘導体))の添加量等の様々な条件の網羅的スクリーニングを行い、測定条件の最適化を行なう.
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