2012 Fiscal Year Annual Research Report

インフルエンザウィルスの大流行を阻止するスーパー抗体酵素の創製

Research Project

Project/Area Number	24350085
Research Category	Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
Research Institution	Oita University
Principal Investigator	一二三恵美大分大学, 全学研究推進機構, 教授 (90254606)
Project Period (FY)	2012-04-01 – 2016-03-31
Keywords	インフルエンザウィルス / 抗体酵素 / 感染抑制
Research Abstract	平成24年度は、スーパー抗体酵素の候補となるヒトkappa型軽鎖遺伝子ライブラリーを作製し、有用クローンの選別を進めた。ここで作製したライブラリーに抗インフルエンザウィルス活性を有すクローンが含まれるか否かは、本研究の根幹に係わる重要なポイントであることから、kappa鎖遺伝子のクローニングから発現・精製・スクリーニングにいたる一連の過程を出来るだけ迅速に行うための方法を検討した。まず候補遺伝子ライブラリーの作製では、クローニングベクターを介して発現用ベクターに組み換えると手法としては確実であるが時間を要す。そこで、候補となるkappa鎖遺伝子をPCR増幅後、直接発現用pET20b(+)ベクターに組み込む方法を選んだ。また、スクリーニング用の発現・精製は、迅速化を図るために小スケール発現と半自動精製装置のMaxwell 16を用いる方法を計画していた。しかしながら、大腸菌可溶性画分への発現量が予想より少ない傾向があり、また発現量が比較的多いクローンであっても精製収量・純度ともに想定より低い結果となった。そこで、この方法を断念し、1Lスケールの培養を行ってNi-NTAカラムクロマトグラフィーと陽イオン交換クロマトグラフィーの二段階精製を行う方法へと方針を変更した。この方針変更による精製効率の低下を危惧したが、半自動精製装置を用いる場合も透析に費やす時間が律速となり、上述の変更による遅延は大きな問題にはならず、むしろ高純度の精製標品が十分量用意出来、その後の実験が進めやすくなった。精製クローンについては、順次プラークアッセイによるインフルエンザ感染抑制試験を実施している。まだ実施数は少ないが、H1N1型やH3N2型のウィルスに対して弱い感染抑制効果を示す結果が出ているので、精製ロット差を含めて再現性の確認を進める。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 概要に記載した通り、大腸菌発現した軽鎖の精製方法を変更せざるを得なかったが、変更による効率低下は予想よりも少なく、少し時間を要しても精製標品の純度と量の高くなる方法を取ったことで、続くin vitroアッセイの精度が担保出来、より確実なスクリーニングが進んでいる。従って、全体としては順調に進展していると判断した。
Strategy for Future Research Activity	得られた軽鎖タンパクの機能評価はHIN1型ウィルスとH3N2型ウィルスを用いるプラークアッセイを中心に進める。この試験に用いるウィルスの品質が分析精度に大きく影響することが明らかになったので、現在、ウィルスの管理方法を検討中であある。ウィルスストック作製時の評価基準を厳しくし、日常のプラークアッセイにおいても、バラツキの出やすい濃度範囲のコントロールを追加して精度管理を徹底する。分析精度の改善を確認の後に、2009年HIN1型などの新しいウィルス株に対する試験に入る。これらin vitroの試験で効果を示したクローンについてはin vivo感染抑制試験により効果の検証を進める。
Expenditure Plans for the Next FY Research Funding	H24年度は、軽鎖クローンの精製にMaxwe11 16を用いる計画であり、精製用のカートリッジ(キット)を大量に購入する予定であったが、精製方法を変更したので不要となり、主にこの経費を平成25年度に繰り越した。H25年度からはin vivoの感染抑制試験を予定しており、in vitroで良好な結果を得たできるだけ多くのクローンをin vivo実験にすすめたいと考えている。重要なクローンについては、現有施設で取り扱うことの出来ない亜型のウィルスに対する効果を含め、客観的なデータを得るために専門施設に外部発注を予定している。昨年度から繰り越した費用を使って、出来るだけ多くのクローンについて上述のin vivo実験データを得たいと考えている。