2013 Fiscal Year Annual Research Report
凍結手術と凍結保存への適用を目指した成熟神経細胞の凍結に関わる基礎的特性
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24360083
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| Research Institution | Kyushu Institute of Technology |
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Principal Investigator |
石黒 博 九州工業大学, 生命体工学研究科(研究院), 教授 (30176177)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 熱工学 / 生体熱工学 / 凍結手術 / 凍結保存 / 成熟神経細胞 / 凍結・融解挙動 / 生存性 / 形態変化 |
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| Research Abstract |
凍結手術と凍結保存への適用を目指し、学術的にも興味深い神経突起を有する成熟神経細胞に対して、凍結・融解特性（凍結・融解過程のミクロ挙動、凍結・融解後の細胞の形態変化と生存性）を解明する。
平成24年度には、細胞凍結の基礎的特性を把握するために、成熟神経細胞の汎用的モデル細胞である分化型PC12細胞（ラット副腎髄質褐色細胞腫由来PC12細胞株）を作製する共に、基質に付着した当該細胞と生理食塩水を用い凍結実験を行った。平成25年度には、凍結保存を念頭において、その特性に対する凍結保護物質の影響を明らかにした。
1. 実験材料： 未分化型PC12細胞の増殖過程で分化誘導を行い、分化型PC12細胞が約80%以上の実験試料を準備した。
2. 実験方法： 汎用的な凍結保護物質であるジメチルスルホキシド（DMSO）10v/v%を添加した生理食塩水中で付着神経細胞の凍結・融解特性を調べた。一様温度分布低温ステージを用いて，冷却速度0.1~74.3℃/minで，最低到達温度-80.0℃まで冷却され，そこで10分間滞在後，加温速度~30℃/minで加温した。融解後20℃で，形態変化の観察・画像計測を行うと共に，細胞の生存率を求めた．
3. 結果： (1)数珠状変化がわずかに生じるが、短小化は殆ど起こらず、DMSOの添加により形態変化は大きく軽減された。 (2)形態変化の詳細として、細胞骨格の一種の中間径フィラメントを構成するタンパク質であるNF-Lの分布は、神経突起の軸に沿って一様に分布し、(1)と同様、DMSOの添加により当該形態変化が大きく軽減された。 (3)凍結・融解後の細胞の生存率は、冷却速度に対して逆U字型の分布を示し、冷却速度0.5~1.0°C/min付近で極大値約40%を取り、DMSOの添加により大幅に向上した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成24年度に、基本的な水溶液である生理食塩水中で付着した分化型PC12細胞の凍結・融解挙動、形態変化、生存率の特性に対する冷却速度と最低到達温度の影響を調べたのに対して、平成25年度は、それらの特性に対する凍結保護物質添加の影響を明らかにした。これらの内容は、研究計画にほぼ沿っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
凍結保存を念頭におき、DMSOを添加した生理食塩水中で、平成25年度には基質に付着した分化型神経細胞の場合の生存率を求めたが、生存率に対する付着の有無（付着状態、懸濁状態）と未分化の影響を調べる。また、神経突起の形態変化の発生過程を時系列で調べると共に、凍結・融解後の当該形態変化を定量的に解析・評価する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
平成24,25年度予算において、ハイスピードマイクロスコープに代わって、赤外線放射温度計と顕微鏡用レンズヒータを購入したことにより、助成金の次年度繰越が発生した。
細胞の形態変化の詳細として特定の分子に注目し調べるために、その専門知識と技術に対する謝金に当てることとした。
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