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2012 Fiscal Year Annual Research Report

単一細胞内DNA分子数の新規デジタルカウンティング手法の開発

Research Project

Project/Area Number 24360344
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Research InstitutionWaseda University

Principal Investigator

竹山 春子  早稲田大学, 理工学術院, 教授 (60262234)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 横田 恭子  国立感染症研究所, 免疫部, 室長 (20182701)
Project Period (FY) 2012-04-01 – 2015-03-31
Keywords単一細胞 / デジタルカウンティング / HIV / 一分子PCR / DNA
Research Abstract

細胞中に含まれる遺伝子情報は、その多様性から発現数までさまざまである。さらに、個々の細胞活性によってその遺伝子発現も変化に富んでいる。細胞内で低コピーに存在する遺伝子情報(mRNA)の重要性は指摘されているが、確実に計測する方法に乏しかった。本研究では、単一細胞中に含まれる低コピーのDNA分子をデジタル精密計測する手法論を開発することを主な目的とし、それらの実証をHIVの感染過程の解明研究で行うこととした。ウイルスの潜伏は、個々の細胞活性が大きく影響することもあり、細胞ごとに計測することが望まれている。本手法を用いれば初期感染で導入されたウイルスの遺伝子情報や、感染後期過程における核から翻訳されたHIVmRNAも低コピーで計測が可能であり、感染プロセス解明に大きく寄与する。具体的には、本研究は、3年間の研究期間で10コピー以下の低コピーDNA分子をターゲットとしたデジタル精密計測技術を確立し、HIVウイルス感染初期過程におけるX4型、R5型ウイルスの存在量を細胞ごとに計測し、細胞活性との相関を得ることを目的としている。具体的には、DNA一分子計測システム(デジタルカウンティング)を確立し実証する。さらには、それらの原理を応用して、よりハイスループット性の高い、一機貫通プロセスシステムの完成を目指す。HIVの感染過程は、感染細胞の活性を受けることが示唆されており、本研究で確立する技術により単一細胞レベル計測することでHIV感染機構の解明につなげる。
本年度は、竹山はDNA一分子計測システムの開発を行った。一つは、ターゲットDNA分子をキャピラリープレートチャンバーに一分子ずつ導入し、チャンバー内でPCR増幅後、ターゲット分子の可視化による分子カウントを行う手法、もう一つは、マイクロ流体工学技術を用いた核酸一分子計測を可能とするマイクロドロップを用いたデジタルカウント手法である。横田は、HIV感染機構の解明を行うためにT細胞株を用いてGFP発現レンチウイルスを作成し、細胞感染モデルを作製した。さらに、ターゲットウイルスの逆転写産物のRT-PCR定量系を最適化した。そして、竹山は、そのモデル系を用いたデジタルカウントシステムの検討を行った。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

それぞれの機関が、本研究で必要な要素技術の確立が順調に行われた。

Strategy for Future Research Activity

25年度以降は、より低コピーの分子を細胞溶解駅から正確にデジタルカウントできるかを、細胞を調整する横田とデバイスを用いたデジタルカウント技術を開発した竹山とでより緊密に連携して研究を推進する。

  • Research Products

    (9 results)

All 2012

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results) Presentation (6 results) Book (1 results)

  • [Journal Article] Expansion of activated memory CD4+ T cells affects infectivity of CCR5-tropic HIV-1 in humanized N0D/SCID/JAK3null mice.2012

    • Author(s)
      Terahara, K., Ishige, M., Ikeno, S., Mitsuki, Y-y., Okada, S., Kobayashi, K., Tsunetsugu-Yokota, Y
    • Journal Title

      PLoS One

      Volume: 8 Pages: 8

    • DOI

      10.1371/journal.pone.0053495

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] HIV-1 infection ex vivo accelerates measles virus infection by upregulating signaling lymphocytic activation molecule (SLAM) in CD4+ T cells2012

    • Author(s)
      Mitsuki, Y-Y., Terahara, K., Shibusawa.K., Yamamoto, T., Tsuchiya.T., Ishige, M., Kobayashi, K., Morikawa, Y., Nakayama, T., Takeda, M., Yanagi, Y., Tsunetsugu-Yokota, Y
    • Journal Title

      J. Virol

      Volume: 86 Pages: 7227-7234

    • DOI

      10.1128/JVI.06681-11

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] Humanized mice as animal model for Human-tropic virus infection2012

    • Author(s)
      Tsunetsugu-Yokota, Y., Ishige, M., Ikeno, S., and Terahara, K.
    • Organizer
      Immunological Mechanisms of Vaccination, Keystone Symposium
    • Place of Presentation
      Ottawa, Canada
    • Year and Date
      20121213-20121218
  • [Presentation] Development of Capillary-Plate-Based Digital PCR System for Analysis of HIV in Single-Cells2012

    • Author(s)
      Motoomi Suzuki, Tetsushi Mori, Kazutaka Terahara, Yasuko Yokota-Tsunetsugu, Haruko Takeyama
    • Organizer
      International Joint Symposium on Single-Cell Analysis (The 6th International Workshop on Approaches to Single-Cell Analysis & The 8th International Forum on Post-Genome Technologies)
    • Place of Presentation
      京都市、京都
    • Year and Date
      2012-11-27
  • [Presentation] Development of a high-throughput microfluidic system for screening of single bacterial cells2012

    • Author(s)
      Yuri Hoshino, Tomotada Hirose, Donghyun Yoon, Tetsushi Mori, Tetsushi Sekiguchi, Shuichi Shoji, Haruko Takeyama
    • Organizer
      International Joint Symposium on Single-Cell Analysis (The 6th International Workshop on Approaches to Single-Cell Analysis & The 8th International Forum on Post-Genome Technologies)
    • Place of Presentation
      京都市、京都
    • Year and Date
      2012-11-27
  • [Presentation] 海洋遺伝子資源の有効活用とシングルセル解析研究について2012

    • Author(s)
      竹山春子
    • Organizer
      第50回ワーキンググループ会議
    • Place of Presentation
      新宿、東京
    • Year and Date
      2012-11-21
  • [Presentation] キャピラリープレートを用いた単一細胞解析のためのデジタルPCR法の開発とHIV研究へのアプローチ2012

    • Author(s)
      鈴木基臣、モリテツシ、寺原和孝、横田(恒次)恭子、竹山春子
    • Organizer
      第6回バイオ関連化学シンポジウム
    • Place of Presentation
      札幌市、北海道
    • Year and Date
      2012-09-06
  • [Presentation] Development of High-throughput Screening System using Microfluidic Device2012

    • Author(s)
      Yuri Hoshino, Tomotada Hirose, Donghyun Yoon, Tetsushi Mori, Tetsushi Sekiguchi, Shuichi Shoji, Haruko Takeyama
    • Organizer
      The 9th Asia-Pacific Marine Biotechnology Conference
    • Place of Presentation
      高知市、高知
    • Year and Date
      2012-07-13
  • [Book] 遺伝子工学(近藤昭彦・芝崎誠司編著)2012

    • Author(s)
      竹山春子
    • Total Pages
      4
    • Publisher
      化学同人(分担執筆:第11章 バイオ計測の項)

URL: 

Published: 2014-07-16  

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