2014 Fiscal Year Annual Research Report
単一細胞内ＤＮＡ分子数の新規デジタルカウンティング手法の開発
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24360344
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| Research Institution | Waseda University |
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Principal Investigator |
竹山 春子 早稲田大学, 理工学術院, 教授 (60262234)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
横田 恭子 東京工科大学, 公私立大学の部局等, 教授 (20182701)
細川 正人 早稲田大学, 付置研究所, 助教 (60722981)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | DNA / HIV / デジタルカウンティング / 一分子PCR / 単一細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞中に含まれる遺伝子情報は、その多様性から発現性まで様々である。さらに、個々の細胞活性によってその遺伝子発現も変化に富んでいる。本研究では、単一細胞中に含まれる低コピーのDNA分子をデジタル精密計測する手法の開発を主な目的とし、本年度においては、過去2年間で開発した分子カウントシステムの高度化を行った。
DNAの微小液滴への封入と液滴への加熱を連続して行えるマイクロ流体デバイスを設計し、On-chipでのPCR反応を試みた。また、2種のプローブをドロップレットに包埋することにより、液滴内における2遺伝子の同時検出について検討した。開発したシステムの応用として、HIV-1を模したレンチウイルス（X4型とR5型）を同時感染させた細胞をモデルとして使用し、細胞内ウイルスDNAのコピー数をマルチプレックスPCR法により測定可能か検証した。
開発したマイクロ流体デバイスの使用により、DNA分子を約10万個のピコリットル容量の微小液滴に封入し、同一デバイス上でPCRの熱サイクルを印加することで液滴内部のDNA分子を増幅・検出できる構造とした。本年度は、デバイスの設計・送液の条件を最適化することで、液滴のサイズや数を簡易に制御可能とした。次に、モデルDNAを用いて液滴ベースのデジタルPCRの定量性を評価し、標的DNAの希釈段階に応じて蛍光を示すドロップレットの割合が変化することを確認した。さらに、2色の蛍光色素を指標とすることで、2種の遺伝子の同時検出が可能であることを確認した。本システムを利用し、ウイルス感染細胞をサンプルとしてウイルスDNAの感染動態を追跡した結果、細胞内におけるウイルスDNAのコピー数の経時的な増加が確認された。実験結果からは、細胞内のウイルスDNA数は想定以上に少ないことが示された。以上の結果から、本技術はウイルスの感染進行過程の解析に利用できることが示唆された。
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| Research Progress Status |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Causes of Carryover |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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[Journal Article] Humanized mice dually challenged with R5 and X4 HIV-1 show preferential R5 viremia and restricted X4 infection of CCR5+CD4+ T cells.2015
Author(s)
Terahara, K., Ishige, M., Ikeno, S., Okada, S., Kobayashi-Ishihara, M., Ato, M., and Tsunetsugu-Yokota, Y
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Journal Title
Microbes and Infection
Volume: 10.1016/j.micinf.2015.02.002
Pages: In press
DOI
Peer Reviewed
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