2012 Fiscal Year Annual Research Report
新規DNA領域におけるセントロメア機能確立の分子機序
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24370003
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
石井 浩二郎 大阪大学, 生命機能研究科, 特任准教授 (40360276)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 染色体 / セントロメア / キネトコア / 細胞周期 |
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| Research Abstract |
今年度は、機能不完全な状態のネオセントロメアと正常機能が確立されたネオセントロメアの間で分子構造基盤を比較し、その間で起こった分子的な変化の解明を試みた。私たちはこれまでに、分裂酵母3番染色体セントロメア破壊の復帰変異として得られるネオセントロメアは機能が不完全であるが、その不全性はその後30世代程度の細胞増殖の間に再現性よく自然解消されることを見出している。その間に起こった分子的な変化を明らかにするために、まずはセントロメア本来の構成タンパク質の集積度合いの違いを解析した。クロマチン免疫沈降とマイクロアレイを組み合わせたChIP-chip実験を主な解析手法として用い、定量PCR解析による確認も組み合わせた。その結果、セントロメア本来の構成タンパク質CEM)-C、CENP-T、Mis6、Mis12には顕著な違いがないが、CENP-Aの結合量が増加していることを見出した。CENP-Aのローディングに関与する因子としてMis6/Sim4複合体、Mis16/Mis18複合体とScm3シャペロンが知られている。Mis6については変化がないことを既に確認済であるが、Mis6以外の因子の結合量に変動がないか、現在タグ付け株を作成して解析を進めている。また、ネオセントロメアの機能正常化がネオセントロメアを担うゲノムDNA配列の変化を伴っていないかについても検証を行った。ネオセントロメアの機能性が変化する前後において、それぞれネオセントロメアを形成しているゲノムDNA19,250塩基対の配列を決定し、1塩基の変化も生じていないことを確認した。一方で、ネオセントロメア形成領域に隣接するrDNA反復配列のコピー数に大きな変動があり、極端にrDNAが短縮化している可能性をパルスフィールドゲル電気泳動によって見出した。また同時に、ヘテロクロマチンと機能正常化の直接的な関係性を解析するため、人為的ヘテロクロマチンのネオセントロメアへの付加実験を試みた。付加株の作成は既に完了し、現在その効果の解析を進めている段階である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究ではセントロメアの機能変遷過程の分子背景と作用機序を解明することを目的としているが、今年度計画していたセントロメア構成基本因子と構成ゲノムDNAの変化の解析は完了した。セントロメア制御因子とヘテロクロマチンの関与検証も順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今年度見出したCENP-A結合量の変動の原因についての究明を推し進める。また、ヘテロクロマチンおよび隣接するrDNAリピートとの関連性についても今後解明を進める。これらは研究計画に則った進捗である。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
ゲノムシーケンス解析が当初想定していたよりもスムーズに完了し、次年度の使用額に加えることになった。次年度は、本年度の結果を受けて、ヘテロクロマチン解析とChIP-chip解析の作業要員が多く必要となることが予想され、その人件費に組み込んでいく計画である。
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