2013 Fiscal Year Annual Research Report
３’から５’方向への鋳型依存ＲＮＡ伸長反応を行う酵素Ｔｈｇ１の分子機構解明
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24370042
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
田中 勲 北海道大学, 先端生命科学研究科(研究院), 特任教授 (70093052)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
姚 閔 北海道大学, 先端生命科学研究科(研究院), 教授 (40311518)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | X線結晶構造解析 / DNA/RNAポリメラーゼ / 核酸 / タンパク質 / グアニン転移酵素 / tRNA修飾 / アミノアシル合成酵素 / 鋳型依存伸長反応 |
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| Research Abstract |
Thg1は，tRNA(His)の5'末端にG塩基を付加する酵素であり，通常のDNA/RNAポリメラーゼと逆向きにRNAを伸長する能力を持つ．本研究ではThg1とtRNA(His)複合体のX線構造解析を行い，その構造をもとにThg1による逆向きの塩基伸長反応の分子機構の詳細を解明するとともに，通常の鋳型依存DNA/RNA伸長反応と本酵素の関係を明らかにして，鋳型依存DNA/RNA伸長反応の分子進化の謎に迫ることを目的としている．このために，真核生物型Thg1とtRNA(His)複合体の構造解析，および原核生物型Thg1の単体およびtRNA(His)複合体の構造解析を行い，DNA/RNAポリメラーゼと比較することで，鋳型依存DNA/RNA合成の分子生物学の新しい展開を図ることを計画した．
平成25年度は，3.1Å分解能で解析した原核生物型Thg1（proThg1）の構造の精密化を終了させ，得られたproThg1の構造を，euThg1-tRNA複合体の構造と重ね合わせて構造比較を行った．proThg1では，euThg1においてtRNAのアクセプターステムを認識するヘリックスα5が，活性部位に向かって4.8Å内側に配置していた．このヘリックスα5により，tRNAのアクセプターステムがThg1内部により深く押し込まれ，5'末端の＋3位まで欠失したtRNAに対するヌクレオチド付加が可能になると考えられる．さらに，tRNA(His)複合体（proThg1-tRNA(His)複合体）の結晶化にも成功，構造解析を進めている．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
予定通り，原核生物型Thg1の構造解析に成功し，真核生物型Thg1との構造比較を可能にした．さらに，原核生物型Thg1とtRNAとの複合体の構造解析も進めている．
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| Strategy for Future Research Activity |
平成25年度の研究に引き続き，proThg1（-tRNA(His)複合体）の構造解析を行う．構造が決定できたら，euThg1-tRNA(His)との立体構造比較を行い，3'-5'方向RNA伸長反応の違いを考察する．構造比較は，euThg1-rRNA(His)複合体の構造機能解析により明らかにしたG(-1)付加反応部位を中心に行い，それによって3'-5'RNA伸長反応に関与すると考えられるアミノ酸残基を同定する．立体構造比較から見出した，3'-5'方向RNA伸長反応に関与すると考えられるアミノ酸残基に変異を導入し，3'-5'方向RNA伸長反応活性測定を行い，仮説の検証を行う．また，euThg1はGまたはCのみを基質とし，proThg1はすべての塩基を基質に利用できる．この基質特異性の違いも両者の立体構造比較から推測する．最終的に，Thg1が有する3'-5'方向RNA伸長反応機構の全体像を明らかにし，Thg1の試験管内進化を行うための構造基盤を確立する．また，本研究で得られた結果を取りまとめ，成果の発表を行う．
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
平成25年度は，計画していた構造解析（蛋白質の精製と結晶化も含む）が非常に順調に進んだので，使用予定の経費の一部を節約することが可能になった．
国際的に競争の厳しい分野であるので，可能なすべての経費を使って変異体解析などの研究を急ぐとともに，著名な国際誌に論文として発表する際に必要となる多くのデータを集めるのに使用する．
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