2014 Fiscal Year Annual Research Report
細菌のＴｏｌＣ共役型異物排出タンパクのＸ線結晶構造解析
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24370045
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
中島 良介 大阪大学, 産業科学研究所, 准教授 (20379100)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 蛋白質 / 細菌 / 抗生物質 / 感染症 / 多剤耐性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
緑膿菌はしばしば多剤耐性化して臨床の場で問題となっているが、多剤排出タンパクがこの耐性化の主要な原因である。また現状ではこの病原菌に対する有効な治療薬はない。
我々は感染症の原因菌である緑膿菌の持つRND型多剤排出タンパク（TolC共役型）MexBの結晶構造を解くことに成功し、次いで特異的阻害剤（ABI-PP）との結合構造の解析にも成功した。しかし、MexBは基質を加えなくともタンパクの安定化に用いる界面活性剤(DDM)を結合したいわゆる基質結合型として構造解析されたため、抗生剤等の結合型を調整することができなかった。26年度はDDM以外の界面活性剤を用いることで非基質結合型を調整すること、DDM存在下であっても結合しうる基質の探索に取り組んだ。その結果、LMNG結合型結晶を作成して3.6Å分解能での構造決定に成功した。これまでに得られていたABI-PP結合サイトとも、DDM結合サイトとも明確に異なる結合位置が判明した。これは異物排出トランスポーターオリエンテッドな構造に基づいた創薬の足がかりとなる成果である。
これまでにTolC共役ABC型排出タンパクMacBの大量発現を達成し、可溶化に適した界面活性剤の絞込みは完了していたが、断片化の問題が結晶化の大きな障害になると考えられた。大腸菌発現系ではタグ精製後も夾雑物が含まれ、このうちの幾つかは末端のHis-tagを含むMacB断片であることが判明した。他のバンドもMacBの断片であることが予想される。これに対して無細胞発現系を用いると断片化を回避できる事を見出した。小麦胚芽を利用した無細胞発現系を用いた場合、精製MacB画分は勿論のこと、MacB発現リポソーム画分にも断片は観測されない。申し分ない発現量は既に達成されており、今後は発現系の大容量化を検討する。
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| Research Progress Status |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Causes of Carryover |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
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