2014 Fiscal Year Annual Research Report
クランプによるレプリソームの制御機構の機能構造連関の研究
| Project/Area Number |
24370046
|
|---|
| Research Institution | Kyushu University |
|---|
Principal Investigator |
真柳 浩太 九州大学, 生体防御医学研究所, 助教 (50418571)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
白井 剛 長浜バイオ大学, 公私立大学の部局等, 教授 (00262890)
大山 拓次 山梨大学, 総合研究部, 助教 (60423133)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
|
| Keywords | 電子顕微鏡 / ナノバイオ / 生体分子 / 可視化 / 生物物理 / 単粒子解析 / DNA複製 / クランプ |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度に引続き、複製因子とクランプの複合体の構造解析を行った。本年度は複合体を形成する上で、より安定な条件をゲル濾過、画像解析、構造解析の結果から検討した。またDNA基質を変えることで受ける影響等を調べた。画像解析、構造計算に於いてはベイズ統計を用いた解析ツールを導入し、画像及び立体構造の分類をこれまでより厳密にすることで、構造、組成がヘテロな系に対応できるように計った。その結果FEN-Lig-PCNA-DNA複合体について、構成因子のほぼ全てを可視化することに成功し、結晶構造等を当てはめることで原子モデルを構築することに成功した。この他、NucS-PCNA-DNA複合体の解析を行い、分担者白井によって得られたNucS―DNA複合体の結晶構造と比較することにより、複合体モデリングツールによって構築した予想モデルを指示する平均像を得ることができた。PolDに関しては２つのサブユニットを等量含む最適な精製条件を見いだし、PCNA及びDNAとの複合体をゲル濾過によって精製した。また新たに導入した構造計算ツールは、ベイズ統計を利用するため、これまでより段違いの計算量を要する。これに対処するために６４コアのワークステーションを導入した。現在はクラスター化することで、さらに収束条件の探索の高速化を検討している。既に試験的に小規模なシステムを構築し、ほぼ予想通りに高速化されることを確認した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
4者複合体の解析が進展し構成因子を全て可視化することに成功した。特にDNAに関してはそのほぼ全長を可視化で来た点は注目に値する。この構造は異なる複数の複製因子をクランプ上に保持し、且つDNAも捉えた最初の例であり、切換えの機構を考える上で極めて重要である。凍結試料の解析も進行しており、進展の具合は概ね順調である。
基質の違い、変異体による差異なども明らかになってきている。更にNucS-PCNA-DNAや、PolD-PCNA-DNA等、新規の試料についても解析が開始された。
|
| Strategy for Future Research Activity |
現在、最も進展しており、且つ生物学的意義も高い、FEN-Lig-PCNA-DNA4者複合体の構造解析を中心に進め、複製因子の切換え機構を考察、誌上発表の準備を進める。またFEN-PCNA-DNA 3者複合体に関してもDNA、FENを更に明確に可視化する。この複合体は4者複合体の解析の重要なレファレンスであることに留まらない。既にPol-PCNA-DNA及びLig-PCNA-DNAを我々が解析しているので、本複合体を解析することで、ラギング鎖複製における重要な複合体の３つを全て解くことの意義は大変に大きいので早急に進める。またフラップの可視化においては、DNAナノ構造体による標識等も検討する。またDNA基質や複製因子の変異体によってどのように複合体形成、安定性、構造が変化するかを検討していく。
|
| Causes of Carryover |
均一な試料作成のために必要な合成DNA探索等が比較的効率良く行え、また構造解析用計算機が交渉の結果及び購入時期などにより、当初の予定より高性能なものがより低価格で購入できた。逆にプロジェクトの進行の過程で、ある程度の性能を有した実体顕微鏡が必要となり２６年度内の購入を検討したが、２７年度開始早々に購入することを決めたため、次年度使用額が生じた。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
試料観察や電子顕微鏡の電子銃交換等のメンテナンス作業に必要な実体顕微鏡を購入する。
|
-
-
-
[Journal Article] Clustering of 3D structure similarity based network of secondary metabolites to reveal their relationships with biological activities2014
Author(s)
Ohtana Y, Azamimi A, Altaf-Ul-Amin M, Huang M, Ono N, Sato T, Sugiura T, Horai H, Nakamura Y, Morita A, Lange KW, Kibinge NK, Katsuragi T, Shirai T, Kanaya S
-
Journal Title
Mol. Inform.
Volume: 33
Pages: 790-801
DOI
Peer Reviewed
-
[Journal Article] Aicardi-Goutières Syndrome Is Caused by IFIH1 Mutations2014
Author(s)
Oda H, Nakagawa K, Ade J, Awaya T, Funabiki M, Hijikata A, Nishikomori R, Funatsuka M, Oshima Y, Sugawara Y, Yasumi T, Kato H, Shirai T, Ohara O, Fujita T, Heike T
-
Journal Title
Am J Hum Genet
Volume: 95
Pages: 121-125
DOI
Peer Reviewed
-
-
-
-
-
-
[Journal Article] Structural design and synthesis of arylalkynyl amide-type peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPAR γ)-selective antagonists based on the helix12-folding inhibition hypothesis2014
Author(s)
Ohashi M, Gamo K, Tanaka Y, Waki M, Beniyama Y, Matsuno K, Wada J, Tenta T, Eguchi J, Makishima M, Matsuura N, Oyama T, Miyachi H
-
Journal Title
Eur J Med Chem
Volume: 90
Pages: 53-67
DOI
Peer Reviewed
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
[Presentation] Single particle analysis of molecular architecture of DNA replication fork complex and switching mechanism of replication factors2014
Author(s)
Mayanagi K, Kiyonari S, Nishida H, Ishino S, Fujikane R, Saito M, Kohda D, Ishino Y, Shirai T, Morikawa K, Mayanagi K, Kiyonari S, Nishida H, Ishino S, Saito M, Kohda D, Ishino Y, Shirai T, Morikawa
Organizer
18th International Microscopy Congress
Place of Presentation
Prague Czech, Republic
Year and Date
2014-09-07 – 2014-09-12
-
-
-
[Presentation] Molecular architecture and switching mechanism of the replication fork complex2014
Author(s)
Mayanagi K, Kiyonari S, Nishida H, Ishino S, Saito M, Kohda D, Ishino Y, Shirai T, Morikawa K
Organizer
Gordon Research Conference,Three Dimensional Electron Microscopy
Place of Presentation
Girona, Spain
Year and Date
2014-06-22 – 2014-06-27
-
-
-
[Patent(Industrial Property Rights)] 耐熱性ミスマッチエンドヌクレアーゼの利用方法2014
Inventor(s)
上森隆司, 石野良純, 相良武宏, 石野園子, 山上健, 白井剛
Industrial Property Rights Holder
上森隆司, 石野良純, 相良武宏, 石野園子, 山上健, 白井剛
Industrial Property Rights Type
特許
Industrial Property Number
2014-184934
Filing Date
2014-09-11
