2015 Fiscal Year Annual Research Report
クランプによるレプリソームの制御機構の機能構造連関の研究
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24370046
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
真柳 浩太 九州大学, 生体防御医学研究所, 助教 (50418571)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
白井 剛 長浜バイオ大学, 公私立大学の部局等, 教授 (00262890)
大山 拓次 山梨大学, 総合研究部, 准教授 (60423133)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 電子顕微鏡 / ナノバイオ / 生体分子 / 可視化 / 生物物理 / 単粒子解析 / DNA複製 / クランプ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
引き続き複製因子とクランプ、及びDNAから構成される複合体の構造解析を行った。昨年度に導入したベイズ統計を用いた解析ツールを利用し、粒子数及び分類するクラスを増やす事でより詳細な解析を行った。DNAのFlapを解消するFEN、ニックを埋めるLigの双方を保持したFEN-Lig-PCNA-DNA複合体については、各構成因子を可視化することができ、溶液中でこの中間状態が、更に２つの状態に部類し得ることを明らかにした。またこの中間状態の前に形成されるFEN-PCNA-DNA複合体の立体構造も得ることができた。FENのエンドヌクレアーゼ活性が極めて高いため、基質であるFlapを用いる際、そのままではFlapが切断されてしまうので、活性部位に変異を入れ、DNAの切断箇所にS化DNAを用いる等して対処し、複合体形成への影響を調べ、安定な複合体を得ることに成功した。FENについてはDNAを欠いたFEN-PCNAの結晶構造が既に得られていたが、 複合体中のFENはこの結晶構造の配置に極めて近く、自身の長軸回りに回転することでDNAとの相互作用を可能にしていることが明らかになった。また、FENとの反応後、Ligの方へDNAが押し込まれ、ニックで屈曲した構造からライゲーション反応のために必要な伸展した構造にDNAが移行して行く様子が捉えられた。両複合体についてはクライオ電子顕微鏡による解析を開始し、凍結試料を用いて、複合体の粒子像を記録することに成功した。また他の因子間におけるDNAの受け渡しの機構の解析にも着手し、PolBからFENへDNAが受け渡される時に形成される、PolB-FEN-PCNA-DNA複合体の精製等に成功した。
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| Research Progress Status |
27年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Strategy for Future Research Activity |
27年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Causes of Carryover |
27年度が最終年度であるため、記入しない。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
27年度が最終年度であるため、記入しない。
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