2012 Fiscal Year Annual Research Report
N型糖鎖修飾のコンセンサス配列占有則を立体構造の視点から解明する
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24370047
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
神田 大輔 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (80186618)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | N型糖鎖修飾 / 翻訳後修飾 / X線結晶解析 / 膜タンパク質 / 糖転移酵素 / 古細菌 / 動的構造 / NMR緩和時間解析 |
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| Research Abstract |
タンパク質のアスパラギン残基への糖鎖付加(N型糖鎖付加)は翻訳後修飾の代表である.コンセンサス配列Asn-X-Thr/Ser中のAsn残基への糖鎖の転移反応はオリゴ糖転移酵素と呼ばれる膜タンパク質酵素が触媒している.N型糖鎖修飾は真核生物だけではなく,古細菌にも広く存在する.また,真正細菌の一部にも存在する.OST酵素の触媒サブユニットはSTT3/AglB/PglB(真核/古細菌/真正細菌)と呼ばれるタンパク質である.我々はAglBのC末端球状ドメインの結晶構造には大きな可塑性を示すセグメントがあり,また実際に溶液中ではこのセグメントは大きな内部運動を持つことをNMR緩和時間解析を用いて示した.さらに,古細菌のオリゴ糖転移酵素全長を大腸菌の膜分画に発現してアッセイする系を用いて,柔軟性を抑制するような人工的なジスルフィド結合を導入すると,酵素活性が完全に消失するが,還元してジスルフィド結合を切断すると完全に活性が回復することを示した.可動セグメントは糖鎖修飾コンセンサス配列であるAsn-X-Ser/Thr配列の+2の位置のセリンとスレオニン残基を認識するセリン・スレオニンポケットの形成に関与している.したがって,オリゴ糖転移酵素は新生ポリペプチド鎖を効率よくスキャンするために,C末端球状ドメイン内に存在する構造可塑性を巧みに利用している可能性がある.すなわち,コンセンサス配列中のセリンとスレオニン残基を確実に捉え,糖転移が終了したら,すばやくポリペプチド鎖を離して次ぎのコンセンサス配列が来るのに備えるために,ポケットの形成と破壊をすばやく行うようなメカニズムの存在が想定される.
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
OST酵素のC末端内部の柔軟性の活性発現における重要性について論文にまとめて発表した.また,古細菌
Arachaeoglobus fulgidusのOSTのひとつAglB-S1のC末端ドメインの結晶構造も論文にまとめて発表した.膜タンパク質全長の結晶化について,Arachaeoglobus fulgidusのAg1B-Lの結晶のX線回折測定を終了し,構造解析の精密化を進めている.以上のように複数のプロジェクトが並行して順調に進行している.
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| Strategy for Future Research Activity |
Arachaeoglobus fulgidusのAglB-Lの構造精密化を進める.この結晶はアポ状態(基質や生成物が結合していない状態)なので,基質(ペプチドと脂質結合型糖鎖)や生成物(糖ペプチドとリン酸結合脂質)との共結晶の作成と構造解析を目指す.古細菌の糖鎖構造は細菌種ごとにまったく異なるので,Archaeoglobus fulgidus由来のN型糖鎖の化学構造の決定を行い,水溶性脂質結合型糖鎖アナログの化学合成のための情報とする.
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
Archaeoglobus flllglallSのN型糖鎖化学構造決定が当初の予定に比べて遅れているために,水溶性アナログ合成の計画が先送りとなったのが理由である.A. fulgidusのN型糖鎖は,Ms解析から7個のヘキソース単糖(一部は8糖)からなっていることがわかっているが,アノメリックプロトンシグナルの重なりが1H-NMR解析を困難にしている.そこで,菌を培養する際に[13C]グルコースを培地に添加することで,N型糖鎖の13C標識を行い,13C-NMRを用いて解析を進める予定である.
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[Journal Article] Crystallographic and NMR evidence for flexibility in oligosaccharyltransferases and its catalytic significance.2013
Author(s)
Nyirenda, J., Matsumoto, S., Saitoh, T., Maita, N., Noda, N., Inagaki, F., Kohda, D.
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Journal Title
Structure
Volume: 21
Pages: 32-41
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Crystal structure of the C-terminal globular domain of oligosaccharyltransferase from Archaeoglobus fulgidus at 1.75Å resolution.2012
Author(s)
Matsumoto, S., Igura, M., Nyirenda, J., Matsumoto. M, Yuzawa, S., Noda, N., Inagaki, F., Kohda, D.
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Journal Title
Biochemistry
Volume: 51
Pages: 4157-4166
DOI
Peer Reviewed
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