2014 Fiscal Year Annual Research Report
ヒト由来膜タンパク質のＮＭＲ構造解析に向けた基盤研究
| Project/Area Number |
24370048
|
|---|
| Research Institution | Yokohama City University |
|---|
Principal Investigator |
高橋 栄夫 横浜市立大学, 大学院生命医科学研究科, 教授 (60265717)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
竹内 恒 独立行政法人産業技術総合研究所, 創薬分子プロファイリング研究センター, 主任研究員 (20581284)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
|
| Keywords | 膜タンパク質 / NMR |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
ニワトリリゾチーム（HEL）をモデルタンパクして用い、酵母P.pastorisを用いて2H標識、15N標識を行った場合の同位体標識率を定量化した。この結果、2H標識率が90%（培養液の重水素化率は95%）、15N標識率が92%であることが示された。次に、NMR測定感度の高いメチル基に対する選択的13C標識を試みた。メチル基選択的13C標識メチオニンを添加した最小培地において酵母培養を行い、リコンビナントHELを得た後、得られたHELについてNMR測定を行った結果、メチオニンのメチル基に由来すると考えられる1H-13C相関シグナルのみが出現したことから、メチオニンのメチル基の選択的標識に成功したと判断した。本プロトコールを拡張し、メチオニン残基のメチル基を選択的に標識したヒト膜タンパク質（FLAP）を調製し、NMR解析を行った。この結果、通常の主鎖アミド基を対象としたNMR測定では検出することが困難な、膜貫通ヘリックス上に存在するアミノ酸残基に由来するシグナルを検出することに成功した。さらに、本メチル基を観測対象として、酵母膜および大腸菌膜から調製したFLAPの安定性の比較を行ったところ、大腸菌膜から抽出したFLAPについては、経時的なスペクトル変化が観測されたが、酵母膜から抽出したFLAPについては半日を経てもスペクトルが変化しないことが明らかとなった。この結果は、酵母を用いて発現させたFLAPが、大腸菌を用いて発現させたFLAPと比較して安定であることを意味しており、恐らく酵母膜に特徴的な脂質成分（ステロール類など）が、FLAPに強固に結合することで、その安定性を高めている可能性が考えられる。
|
| Research Progress Status |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
|
| Strategy for Future Research Activity |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
|
| Causes of Carryover |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
|
| Expenditure Plan for Carryover Budget |
26年度が最終年度であるため、記入しない。
|
