2012 Fiscal Year Annual Research Report
グループ2型シャペロニンにおけるサブユニット間協調作用機構の解明
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24370064
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
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Principal Investigator |
養王田 正文 東京農工大学, 大学院・工学研究院, 教授 (50250105)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
関口 博史 高輝度光科学研究センター, 利用研究促進部門, 研究員 (00401563)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | シャペロニン / シャペロン / フォールディング / 古細菌 / 構造変化 |
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| Research Abstract |
本研究の目的は、超好熱性古細菌Thermococcus sp. strain KS-1由来グループII型シャペロニン(CPN)のリング間及びリング内サブユニット協調作用機構解明を目的である、本年度は、非対称CPN(CPN^<ASR>)及びリング内に変異を含むCPNを構築し、機能解析を行った。
リング間の協調作用機構解明を目的に、循環置換型連結CPN(CPN^<cpc>)を用いて,野生型サブユニットで構成されたリングと変異型サブユニットのリングからなるCPN^<ASR>の構築と機能解析を行った。CPN^<cpc>は2個のサブユニットを連結し,そのN末端95アミノ酸残基を削除してC末端に付加した変異体である。ArPase活性欠損サブユニットから構築したCPN^<cpc>と野生型サブユニットを共発現させ、CPN^<ASR>を構築した。CPN^<ASR>は十分な基質捕捉能を有しているにも関わらず、フォールディング活性の低下が見られた。また,ATPase活性は野性型の約50%の活性を保持していた。さらに、時分割X線回折追跡法による解析を行い、野生型と同様にATP依存的ねじれ運動を検出した。この結果から、リング間の協調作用は存在するが、不可欠ではないことが示唆された。さらに、リング内の協調作用機構解明を目的に、ループ領域にTrpを導入したL56W変異体と、ATP依存的な構造変化が起こらないArP加水分解活性欠損体を連結させたCpn(FA)_8を作製した。L56W変異体はclosedへ構造変化するとTrpの蛍光強度が増大する。Stopped-flow装置を用いた経時的な構造変化解析では、L56wホモオリゴマーと同様にArp濃度依存的に蛍光強度が増大し、構造変化することが確認された。しかし、L56Wホモオリゴマーに比べCpn(FA)_8の構造変化速度は遅かった。この結果は、ATP依存的に構造変化できないサブユニットが、隣接した野生型サブユニットの効果により構造変化したことを示している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
循環置換型連結CPNの構築が困難であると予想されたが、設計に成功し、予想よりも早く構築することができた。その結果、非対称CPNの構築と機能解析を予定よりも早く実施することが可能となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
循環置換型連結CPNの他に8連結体を用いた非対称CPNの構築を行い、2種類の非対称CPNの機能を比較することで、リング間協調作用機構を解明する。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
本年度はほとんど予定通り予算を執行したが、購入した試薬などの価格の変動によりわずかな剰余金が発生したので、次年度使用することとした。予算執行計画は当初の計画と同じである。
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[Presentation] X線1分子追跡法による11型シャペロニン協同性評価2012
Author(s)
Hiroshi Sekiguchi, Ayumi Nakagawa, Kazuki Moriya, Mayuno Arita, Yohei Yamamoto, Kohei Ichiyanagi, Masafumi Yohda, Naoto Yagi, Yuji Sakaki
Organizer
日本生物物理学会第50回年会
Place of Presentation
名古屋大学東山キャンパス
Year and Date
2012-09-23
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