2012 Fiscal Year Annual Research Report
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24370074
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
宮川 さとみ 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任講師(常勤) (90291153)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | 小分子RNA / 発生・分化 / 精子形成 / 細胞・組織 / タンパク質 |
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| Research Abstract |
MILI欠損マウス由来のGS細胞は、マウス精巣における雄性生殖細胞の表現型と同様に、レトロトランスポゾンの制御領域におけるDNAメチル化の低下と、それに起因する発現上昇がみとめられる。そこで、野生型およびMili欠損GS細胞におけるpiRNA産生についての解析をおこなった結果、野生型GS細胞において盛んにおこなわれているpiRNAの一次産生は、Mili欠損GS細胞においては、著しく障害されていた。また、Mili遺伝子の再導入により作製したMili回復GS細胞においては、piRNAの一次生成による産生が回復するだけでなく、野生型より多量のpiRNAが発現するようになったことから、piRNA一次生成がMILI依存的であることを明らかにした。これらの結果から、GS細胞がpiRNAの一次生成分子機構の解析に極めて有用なツールであることを見いだした。
上記の成果に基づき、MILIと協調してpiRNA一次生成に関与する因子を同定するため、GS細胞におけるMILI結合タンパクの探索をおこなった。その結果、グリセロール-3-リン酸にアシル基を付加し、リゾホスファチジン酸を産生するミトコンドリア膜酵素であるGPAT2を同定することができた。Mili回復GS細胞においてGPAT2をノックダウンしたところ、piRNAの一次生成が著しく障害されていた。さらに、アシル基転移活性ドメインに変異を導入したGPAT2を、GPAT2ノックダウンGS細胞に導入したところ、変異体においてもMILI結合piRNAが産生されており、GPAT2の酵素活性はpiRNA産生と無関係であることを明らかにした。以上の結果から、MILI結合タンパクであるGPAT2がpiRNA一次生成に重要な役割を果たすことを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
GS細胞への遺伝子導入で一部、難航はしているものの、これまでにGS細胞を用いて、piRNAの解析と新たなMILI結合タンパクを樹立しており、おおむね順調にすすんでいる。また、MVH変異マウスの交配も順調にすすんでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
（今後の推進方策）遅延しているGS細胞への遺伝子導入をすすめるのと同時に、昨年度までの結果を進展させる形でGPAT2の結合タンパクを探索し、piRNAの一次生成分子機構の解析をさらにすすめていく。また、MVH変異マウスの解析をすすめ、データをまとめていく。
（次年度の使用計画）GS細胞での二次生成piRNA再構築のための遺伝子導入がうまくいかず、導入遺伝子発現細胞が樹立できなかったため、レトロウィルス発現ベクターを再構築している。再度、GS細胞に遺伝子導入をおこない、細胞を樹立し、二次生成piRNA（MIWI2結合piRNA）が産生されるかどうかを調べ、産生されていれば、次世代シークエンサーによる網羅的解析をおこなう。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
平成24年9月までに、GS細胞への導入遺伝子の構築、導入遺伝子のウィルス作製、GS細胞への遺伝子導入し、平成25年3月までに、遺伝子導入細胞の樹立と解析を行い、その結果の取りまとめを行う予定であった。
平成24年10月、遺伝子を導入したGS細胞でのantisenseIAPの発現をしらべたところ、ほとんど遺伝子の発現がみとめられないことが判明した。ベクターを変えて導入遺伝子の構築およびウィルス作製から再度やり直す必要が生じた。
今回、CSII-レンチウィルスベクターを用いて導入したantisenseIAPの発現は、解析に用いるには導入効率が非常に低かった。このCSII-レンチウィルスベクターは、Kusabira Orange (KO)を発現マーカーとしているが、GS細胞における発現細胞の選択には、KOよりも、薬剤マーカーによる選択の方が効率がよいことがわかった。そこで、薬剤選択可能なベクターに作りかえて発現をこころみる。また、テトラサイクリンの誘導の系でのベクターを作製し、薬剤誘導による発現細胞の作製もこころみる予定である。
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[Journal Article] Targeted gene silencing in mouse germ cells by insertion of a homologous DNA into a piRNA generating locus.2013
Author(s)
3.Yamamoto Y, Watanabe T, Hoki Y, Shirane K, Li Y, Ichiiyanagi K, Kuramochi-Miyagawa S, Toyoda A, Fujiyama A, Oginuma M, Suzuki H, Sado T, Nakano T, *Sasaki H.
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Journal Title
Genome Res.
Volume: 23
Pages: 292-299
DOI
Peer Reviewed
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