2013 Fiscal Year Annual Research Report
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24370074
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
宮川 さとみ 大阪大学, 医学(系)研究科(研究院), 特任講師(常勤) (90291153)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | piRNA / 小分子RNA / 発生・分化 / 精子形成 / PIWI / タンパク質 / 細胞・組織 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
＜MVHの変異体マウスを用いたpiRNA生合成過程とMVHの分子機能解析＞
生殖細胞特異的に発現するRNAヘリカーゼであるMVH（mouse VASA homologue）は、piRNAの生合成に重要な役割を果たしている。今回、ヘリカーゼ活性に必要なアミノ酸の置換によりヘリカーゼ活性Nullの変異体（ΔH-MVH）に、FLAG-tagを付加したTgマウスを作製し、MVH欠損マウスに交配して、ΔH-MVHのみを発現するマウスを作製して解析をおこなった。その結果、レトロトランスポゾンLINE1やIAPの1次産生piRNAはKOと比較して増加していたが、2次生成piRNAはKOマウスと同様に低下していた。一方、MVH-KOマウスで認められた生殖顆粒の消失はΔH-MVHマウスではみとめられず、正常であった。以上のことから、これまで報告してきたpiRNA生合成におけるMVHの２つの役割、①piRNAの合成の場である生殖顆粒形成に重要、②2次生成piRNAの合成に重要、のうち、MVHのヘリカーゼ活性は、2次生成の産生には必要であるが、生殖顆粒形成には必要ないことが明らかとなった。この結果は、MVH欠損マウスでは不明であった、MVHの２つの機能を、ヘリカーゼ活性の有無で分けることができた点で重要な結果であるといえる。
＜GS細胞を用いたpiRNA生合成過程の解析＞
前年度までに、GS細胞を用いてMILI結合タンパクとしてGPAT2 を同定し、1次生成におけるGPAT2の役割を解析してきた。その結果、GPAT2が脂質代謝の酵素活性非依存的に、piRNA産生に重要な役割を果たすことを明らかにしている。生体内におけるGPAT2の役割を明らかにするために、現在、GPAT2のノックアウトマウスを作製し、解析を開始している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
MVHのヘリカーゼ活性Nullの変異体（ΔH-MVH）を発現するマウスの作製、および解析により、MVHのpiRNA産生における役割を明らかにすることができた点でで、順調にすすんでいる。しかし一方で、この変異マウス由来のGS細胞の作製が遅延している。
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| Strategy for Future Research Activity |
遅延しているMVH変異体由来のGS細胞の作製や、GS細胞への遺伝子導入をすすめるのと同時に、前年度までの結果を進展させる形でGPAT2-KOマウスの解析をすすめていく。また、MVH変異マウスの解析をすすめ、データをまとめていく。
GS細胞の解析とマウスを用いた解析（piRNAの網羅的解析やメチル化解析など）にも予算を使用する予定である。
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| Causes of Carryover |
piRNA生合成に関与するMVHのヘリカーゼ活性のないMVH（dH-MVH）トランスジェニックマウスとMVHノックアウトマウス（MVH-KO）マウスを交配したdH-MVHのみを発現するマウスより、GS（germ stem cell：新生仔マウスの精巣由来の生殖細胞）を樹立し、そのGS細胞の性質を詳細に解析し、結合タンパクの同定や解析をおこなう予定であった。しかし、ノックアウトマウス由来のGS細胞は樹立効率が低く、まだGS細胞が樹立できていない。そのため、GS細胞樹立後に行う予定の実験ができていない。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
dH-MVHトランスジェニックマウスとMVH –KOの変異を持つマウスをDBA/2マウスに戻し交配し、新生仔マウスよりGS細胞を樹立し、培養するための費用、piRNAの網羅的解析、およびタンパクの同定やその解析に使用予定である。
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[Journal Article] GPAT2, a Mitochondrial Outer Membrane Protein, in piRNA Biogenesis in Germline Stem Cell.2013
Author(s)
2.Shiromoto Y, *Kuramochi-Miyagawa S, Daiba A, Chuma S, Katanaya A, Katsumata A, Nishimura K, Ohtaka M, Nakanishi M, Nakamura T, Yoshinaga K, Asada N, Nakamaura S, Yasunaga T, Kojima-Kita K, Itou D, Kimura T, and *Nakano T.
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Journal Title
RNA
Volume: 19
Pages: 1-8
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] The nuage mediates retrotransposon silencing in mouse primordial ovarian follicles.2013
Author(s)
Lim AK, Lorthongpanich C, Chew TG, Tan CW, Shue YT, Balu S, Gounko N, Kuramochi-Miyagawa S, Matzuk MM, Chuma S, Messerschmidt DM, Solter D, *Knowles BB.
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Journal Title
Development
Volume: 140
Pages: 3819-3825
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Targeted gene silencing in mouse germ cells by insertion of a homologous DNA into a piRNA generating locus.2013
Author(s)
3.Yamamoto Y, Watanabe T, Hoki Y, Shirane K, Li Y, Ichiiyanagi K, Kuramochi-Miyagawa S, Toyoda A, Fujiyama A, Oginuma M, Suzuki H, Sado T, Nakano T, *Sasaki H.
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Journal Title
Genome Res.
Volume: 23
Pages: 292-299
DOI
Peer Reviewed
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