2014 Fiscal Year Annual Research Report
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24370088
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
日比 正彦 名古屋大学, 生物機能開発利用研究センター, 教授 (40273627)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 小脳 / 神経回路形成 / ゼブラフィッシュ / 蛍光タンパク質 / 可視化 / ライブイメージング / 変異体 / 神経発生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
小脳は円滑な運動の制御のみならず、認識・感情・学習などの高度の神経活動にも関与している。本研究では、ゼブラフィッシュとメダカを用いて、小脳神経回路形成過程の解析を行った。
１．ゼブラフィッシュを用いた神経回路形成のライブイメージング：顆粒細胞・プルキンエ細胞・投射神経・下オリーブ核ニューロン特異的に転写活性化因子Gal4を発現するトランスジェニック（Tg）系統を単離した。Gal4依存性のレポーターTg系統と交配し観察することで、下オリーブ核から反対側のプルキンエ細胞への投射、顆粒細胞からプルキンエ細胞・投射神経・下オリーブ核への直接・間接的接続を確認した。また、小脳体の顆粒細胞の軸索はお互いに反発し合うことで平行線維を形成すること、顆粒細胞軸索形成と細胞体の移動は連動していることを見出した。
２．小脳神経回路形成の分子機構の解明：（１）IV型コラーゲンを介した顆粒細胞軸索形成機構：基底膜を構成するIV型コラーゲンの遺伝子collagen4a6および4a5の変異体では、顆粒細胞軸索走行に異常を示す。走行異常は基底膜の構造異常と関連しており、IV型コラーゲンは基底膜の構造を保つことで、顆粒細胞軸索の走行を制御していることを見出した。（２）Contactin1による小脳神経回路形成機構：失調様遊泳異常を示すメダカ変異体roの原因遺伝子としてcontactin1bを同定した。TALEN法を用いてゼブラフィッシュContactin1a/1b変異体を作製し、Contactin1の機能が脊椎動物で保存されていることを見出した。（３）遺伝子プロファイリング解析：小脳神経回路特異的Tg系統から、蛍光タンパク質の発現を指標に個々の種類のニューロンをFACSで単離し、RNA sequencingを行った。比較解析から、プルキンエ細胞に特異的遺伝子を多数単離し、in situ hybridizationにより発現確認を行った。これらの内、神経回路形成に関与する候補遺伝子に関して、変異体の作製を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
１．ゼブラフィッシュを用いた神経回路形成のライブイメージング：目的とする顆粒細胞、プルキンエ細胞、下オリーブ核ニューロンの可視化に成功した。加えて、投射神経（eurydendroid細胞）およびBergmannグリア細胞の可視化にも成功した。さらに、顆粒細胞特異的Gal4系統を用いて、１細胞レベルの可視化が行え、顆粒細胞軸索構造およびその形成過程に関して詳細な解析を行うことができた。
２．小脳神経回路形成の分子機構の解明：（１）IV型コラーゲンを介した顆粒細胞軸索形成に関しては、メカニズムを提唱することができた。（２）Contactin1の解析に関しては、メダカro変異体およびゼブラフィッシュcontactin1b変異体解析により、Contactin1が遊泳を司る神経回路形成に関与することを見出した。。一方、contactin1a/1bダブル変異体の解析による、発生生物学的・組織学的解析が必要である。（３）遺伝子プロファイリング解析：プルキンエ細胞の詳細な遺伝子プロファイリングを行うことができた。今後は候補遺伝子の変異体を解析することで、プルキンエ細胞が関与する小脳神経回路形成の分子機構の一端に迫れるものと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．ゼブラフィッシュを用いた神経回路形成のライブイメージング：今回用いたTg系統は、個々の種類のニューロン特異的にGal4を発現することができたが、同種の全てのニューロンにGal4が発現している訳ではない。今後は個々のニューロンに特異的に発現する遺伝子の制御領域に、Gal4転写ユニットをCRISPR/Cas9法を用いてノックインし、より良いTg系統の確率を目指す。また、解析が足りなかった登上線維（下オリーブ核ニューロンのプルキンエ細胞への軸索）のトポグラフィックマップの解析を進める。
２．小脳神経回路形成の分子機構の解明：（１）顆粒細胞軸索形成に関しては、基底膜と協力して、顆粒細胞軸索形成を制御するガイダンス分子の候補を見出しており、その変異体の作製を進めている。変異体の表現型を解析することで、顆粒細胞軸索形成の分子機構に迫る。（２）Contactin1の解析に関しては、contactin1a/1bおよびcontactin2の複合変異体を作製し、発生生物学的・組織学的解析を行い、Contactinファミリーの小脳神経回路形成における役割を解明する。（３）遺伝子プロファイリング解析によって見出された、神経回路形成に関与する候補遺伝子の変異体の作製を進め、変異体の解析を行うことで、小脳神経回路形成の分子機構を詳細に解析する。
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| Causes of Carryover |
2014年度に、（１）IV型コラーゲンを介した顆粒細胞軸索形成機構の解析、（２）Contactin1の小脳神経回路形成における役割の解析、（３）ゼブラフィッシュ小脳神経回路特異的トランスジェニックフィッシュを用いた遺伝子プロファイリング解析、に関してデータを取得したが、最終的に論文として発表するためのデータが一部不足している。そのため、2015年度に解析を進め論文を完成させる。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
（１）IV型コラーゲンを介した顆粒細胞軸索形成機構の詳細な解析、（２）Contactin1a/b/2の複合変異体の発生生物学的・組織学的解析、（３）ゼブラフィッシュ小脳神経回路特異的トランスジェニックを用いた遺伝子プロファイリング解析、に関する実験を行い、最終的に論文として発表する。
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[Journal Article] Establishment of Gal4 transgenic zebrafish lines for analysis of development of cerebellar neural circuitry.2015
Author(s)
Takeuchi M, Matsuda K, Yamaguchi S, Asakawa K, Miyasaka N, Lal P, Yoshihara Y, Koga A, Kawakami K, Shimizu T, Hibi M.
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Journal Title
Developmental Biology
Volume: 397
Pages: 1-17
DOI
Peer Reviewed / Acknowledgement Compliant
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[Presentation] Control of axon guidance of cerebellar granule cells by the basement membrane.2014
Author(s)
Takeuchi M, Hayashi T, Yamaguchi S, Yonemura S, Asakawa K, Kawakami K, Takada S, Kuraku S, Shimizu T, Hibi M.
Organizer
11th International Conference on Zebrafish Development and Genetics
Place of Presentation
Wisconsin, USA
Year and Date
2014-06-24 – 2014-06-28
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[Presentation] Dissection of cerebellar neural circuitry with zebrafish Gal4 gene/enhancer trap lines.2014
Author(s)
Matsuda K, Takeuchi M, Asakawa K, Ohkura M, Miyasaka N, Yoshihara Y, Hayashi T, Kuraku S, Kawakami K, Hibi M, Shimizu T.
Organizer
第47回日本発生生物学会大会
Place of Presentation
名古屋
Year and Date
2014-05-27 – 2014-05-30
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