2012 Fiscal Year Annual Research Report
抵抗性昆虫の出現を許さない次世代型Cryトキシンの開発
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24380034
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Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
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| Research Institution | Okayama University |
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Principal Investigator |
早川 徹 岡山大学, 大学院・自然科学研究科, 助教 (30313555)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2015-03-31
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| Keywords | Bacillus thuringiensis / Cry4Aa / Cry4Ba / Cry11Aa / Cyt1Aa / アカイエカ / アラニンスキャニング / 人工遺伝子 |
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| Research Abstract |
本研究では土壌細菌、Bacillus thuringiensisbubsp. israelensis (Bti)が産生する殺蚊トキシン(Cry4Aa及びCry4Ba、Cry11Aa、Cyt1Aa)の作用メカニズムを解析・利用し、「環境に安全且つ持続的利用可能な害虫防除システム」を構築しようと考えている。本年度は以下の3項目について重点的に研究をすすめた。
Btiトキシン生産系の構築:Btiトキシンを簡便且つ効率的に生産するため、既に構築済みのCry4Aa人工遺伝子(cry4Aa-S1)に加えて、Cry4Ba及びCry11Aa、Cyt1Aaの人工遺伝子も構築した。Cyt1Aaについては大腸菌で可溶性タンパク質として大量生産できることを示した。
トキシンの作用機構の解析:Cry11AaドメインIIの分子表面に露出する4つのループ構造(α8、1～3)を標的としたアラニンスキャニング解析を行った。ループの領域を3つに分割して考え、それぞれをアラニンに置換した12種類の変異体を構築した。ループα8及び1、3を置換した変異体で殺虫活性が失われ、これらのループが受容体結合に関与する可能性が示された。しかし天然の遺伝子を基に構築した変異体の生産効率は非常に低く、本年度構築した人工遺伝子を用いて再実験を行う必要がある。一方、QCMデバイスを用いた解析によって、Cry4AaのドメインIIIが標的組織膜タンパク質と高い結合親和性を示すことが明らかになった。ドメインIIIは糖、特にGalNAcやFucose残基を介して標的組織と相互作用する可能性が考えられた。
トキシンの相互作用解析:Cry4Aa、Cry11Aa、Cyt1Aaの相互作用解析する目的で、アカイエカ幼虫を用いた予備的なバイオアッセイを行った。Cry4Aa-Cry11Aa間では阻害が、Cry11Aa-Cyt1Aa間では協調作用が観察された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
既存のCry4Aaに加え、3種の殺蚊トキシン(Cry4Ba、Cry11Aa、Cyt1Aa)をコードする人工遺伝子が構築できた。これでBtiが生産する4種の殺蚊トキシン全ての人工遺伝子が揃い、トキシン間の相互作用を総合的に解析する準備が整った。Cry4AaやCry11Aaの殺虫活性に関わる機能構造についても解析が進み、Cry4AaについてはドメインIIIが、Cry11AaについてはドメインIIのループα8及び1、3がその殺虫活性に関与する可能性が明らかになるなど具体的な成果が挙がりつつある。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1)構築した人工遺伝子を用い、Btiトキシン(Cry4Ba,11Aa,Cyt1Aa)を大腸菌で効率的に生産するシステムを構築する。バイオアッセイの結果を変異体の構築にフィードバックできる系の確率を目指す。
(2)4種のBtiトキシン(Cry4Aa,4Ba,11Aa,Cyt1Aa)間の相互作用(助長、もしくは競合)を明らかにし、Btiトキシンの作用におけるここのトキシンの寄与の度合いを解析する。
(3)Btiトキシン、特にCry4Aaと11Aaの変異体を構築し、殺虫活性に関与する機能構造の特定をさらに進める。機能構造の改変・移植によって新しい殺虫活性が生み出される可能性を探る。
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| Expenditure Plans for the Next FY Research Funding |
Btiに由来する天然型のCry11Aa遺伝子が大腸菌で十分に発現しないことが明らかになったため、変異体の機能構造解析及び相互作用解析に若干の遅れが生じた。しかし高発現型人工遺伝子の構築がCry4Ba,11Aa,Cyt1Aaで完了したため、次年度から全てのBtiトキシン(Cry4Aa,4Ba,11Aa,Cyt1Aa)を用いた総合的な解析を進める。
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