2014 Fiscal Year Annual Research Report
細菌細胞膜における高度不飽和脂肪酸含有リン脂質の機能解析と応用
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24380047
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
栗原 達夫 京都大学, 化学研究所, 教授 (70243087)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
川本 純 京都大学, 化学研究所, 助教 (90511238)
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| Project Period (FY) |
2012-04-01 – 2016-03-31
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| Keywords | 細胞膜 / 脂質 / タンパク質 / 高度不飽和脂肪酸 / エイコサペンタエン酸 / リン脂質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
(1) エイコサペンタエン酸 (EPA) を細胞膜リン脂質の成分として含む細菌 Shewanella livingstonensis Ac10 において、EPA のリン脂質への導入反応を 1-アシル-sn-グリセロール-3-リン酸-O-アシルトランスフェラーゼ PlsC1 が触媒すること、本酵素が細胞分裂部位に局在すること、本菌が本酵素のホモログを 5 種類もつことを見いだしている。PlsC1 のホモログである PlsC4 について、遺伝子破壊株を作製し、リン脂質組成を解析したところ、11-メチルラウリン酸と 13-メチルミリスチン酸を含むリン脂質が顕著に減少していることが明らかとなり、これらの分岐鎖脂肪酸をリン脂質に導入する反応を PlsC4 が担っているものと考えられた。また、GFP 融合型 PlsC4 の蛍光顕微鏡観察から、PlsC4 が細胞の末端領域に局在することが示唆された。以上の結果から、これらの類縁酵素が特定のリン脂質を特定の部位で生合成することが、細胞膜の不均一性を生み出すことに寄与している可能性が考えられた。
(2) EPA 含有リン脂質は S. livingstonensis Ac10 の主要外膜タンパク質 Omp74 のβバレル構造へのフォールディングを加速するシャペロン効果をもつ。本研究では、フォールディングへの EPA 含有リン脂質の影響をより詳細に解析した。精製 Omp74 を 8 M 尿素または 2% SDS で変性させ、これをリポソーム溶液と混合することでリフォールディングさせた。Omp74 は尿素処理で完全に変性したのに対し、SDS 処理では N 末端領域がαヘリックスを形成した部分的にフォールドした状態になることが見いだされた。EPA 含有リン脂質によるフォールディングの加速効果は、SDS で変性させた Omp74 についてもみられた。以上の結果から、Omp74 はαヘリックスを経由して最終的なβバレル構造にフォールディングされ、EPA 含有リン脂質は少なくともαヘリックス形成以降の段階においてシャペロン機能をもつものと考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
細菌細胞膜のリン脂質を生合成する類縁酵素群については、細胞内での基質特異性や局在性の解析において大きな進展が見られ、これらの酵素群が生体膜の高度組織化に寄与することを示唆する結果が得られた。また、EPA 含有リン脂質が膜タンパク質のフォールディングにおよぼす影響についても詳細な知見が得られた。一方、エチニル基修飾型 EPA を用いた EPA の動態解析においてはプローブの調製や細胞への添加条件の検討などに時間を要し、十分な情報が得られていないのが現状である。以上の状況から、「おおむね順調に進展している」と評価することが妥当と考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
エチニル基修飾型 EPA などのプローブを用いた in vivo での EPA および EPA 含有リン脂質の機能と動態の解析を重点的に行う。
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| Causes of Carryover |
EPA の細胞内動態を解析するためのプローブ分子である cEPA や重水素標識型 EPA を夾雑物のない純度の高い状態で十分量調製するための合成方法確立に予想以上に時間を要し、それに伴って、これらのプローブ分子を用いる EPA の細胞内動態解析の一部も次年度に行うこととした。そのため、次年度使用額が生じた。
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| Expenditure Plan for Carryover Budget |
主として、各種プローブ分子の調製に必要な合成用試薬や、EPA の細胞内動態を解析するためのタンパク質解析用試薬･脂質解析用試薬･培養用試薬などの消耗品の購入に使用する計画である。
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