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2012 Fiscal Year Annual Research Report

次世代天然化合物導出を指向した新規生合成ロジックの構築

Research Project

Project/Area Number 24380052
Research Category

Grant-in-Aid for Scientific Research (B)

Research InstitutionThe Institute of Physical and Chemical Research

Principal Investigator

高橋 俊二  独立行政法人理化学研究所, 化学情報・化合物創製チーム, チームヘッド (30311608)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 奥村 英夫  公益財団法人高輝度光科学研究センター, 利用研究促進部門, 研究員 (90377903)
Project Period (FY) 2012-04-01 – 2015-03-31
Keywords放線菌 / リベロマイシン / スピロアセタール / 3級水酸基エステル化 / ポリケチド / アルキルマロニルCoA / 生合成 / 結晶化
Research Abstract

1.スピロアセタール形成機構の解明:RevGは、トリオール体からジヒドロキシケトン構造を形成するSDRファミリーのデヒドロゲナーゼである。RevJはヒドロキシケトンから立体特異的にスピロアセタール環を形成する特異な活性を有する酵素である。酵素の構造詳細をX線結晶構造解析法より得るために、結晶化実験を行った。大腸菌を用いて異種発現・精製を行い、両酵素ともに高純度の精製試料を得ることが出来た。精製サンプルを用いてそれぞれの結晶化条件の探索を行ったが、良質な結晶を得ることができなかった。現在さらに発現条件、精製条件を検討し結晶化スクリーニングを進めている。
2.新規エステル化酵素反応の解明:リベロマイシン生合成において3級水酸基エステル化に関わると予想されるRevK及びRevL反応を生化学的に検証するために、それぞれ大腸菌を用いてHis-tag融合蛋白質を発現し、Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィーにより酵素を調製した。RevLはAMP結合モチーフを有することから、基質にA-rP及び候補基質のジカルボン酸を添加してRevK-RevL複合酵素反応を検討した。
3.2-アルキルマロニルCoA生合成:2-アルキルマロニルCoA生合成に関わると予想されるRevTの機能解析を行った。相同性検索からRevTを還元・カルボキシル化酵素と予想した。基質と予想されるt-2-ヘキセノイルCoAおよびt-2-オクテノイルCoAを用いて、反応生成物と予想されるブチルマロニルCoAおよびヘキシルマロニルCoAへの酵素変換を試みた。Streptomyces lividans TK23を用いた異種発現を行うことで高活性のRevTを精製し、還元・カルボキル化反応を検討した。

Current Status of Research Progress
Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

達成目標として3つのテーマをかかげて研究を進めている。テーマ1の目標であるスピロアセタール構造形成に関わる酵素の結晶解析については、第一段階である酵素精製に成功しているため、結晶化に向けた条件の最適化が今後の課題と考えられる。次年度は、結晶化が困難である事を踏まえた研究を展開する。生化学的な解析を主とするテーマ2,3は概ね計画通りに進んでいる。

Strategy for Future Research Activity

テーマ1:RevG、RevJタンパク質について、次年度は引き続き結晶化実験を精力的に行う。
具体的にはタグ発現の種類・有無、発現領域の再検討に合わせて、精製試料については安定化条件の検討、結晶化条件の検索を行う。良質な結晶が得られた後、大型放射光施設SPring-8にてX線回折実験を行い、構造解析を行う。さらに、基質との複合体結晶を作成し、X線構造解析を行う。
テーマ2,3:当初の計画に従って遂行する

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

25年度
代表者:物品費(25年度補助金分800,000、25年度基金分300,000、24年度基金分190,000)
分子生物学試薬(200,000)、タンパク質精製・結晶化試薬(490,000)、生化学試薬(300,000)、
培養容器及び培地(150,000)、分析カラム・溶媒(150,000)
旅費(25年度補助金分100,000、25年度基金分なし,24年度基金分100,000)
国内学会発表費用(農芸化学会、放線菌学会、生化学会)
人件費・謝金(25年度補助金1,500,000、25年度基金1,100,000、24年度の基金分1,520,000)
研究補助者への人件費
その他(25年度補助金分100,000、25年度基金分なし,24年度基金分100,000)
研究成果発表費用(200,000)
研究分担者:物品費(補助金分500,000)
タンパク質精製試薬、生化学試薬、結晶化試薬・キット
24年度の未使用額の発生理由:
1.24年度の研究基礎に基づき、25年の結晶化研究を加速させるために24年基金分の物品費(190,000)を集約して使用する。
2.25年度は多くの研究発表が見込まれるために24年度基金分の旅費(100,000)を25年度に使用する。
3.研究を集約的に加速させるため、24年度の人件費基金分の一部(1,520,000)を25年度に使用する。

  • Research Products

    (18 results)

All 2013 2012 Other

All Journal Article (3 results) (of which Peer Reviewed: 3 results) Presentation (13 results) Book (1 results) Remarks (1 results)

  • [Journal Article] Creation of novel reveromycin derivatives by alcohol-added fermentation2013

    • Author(s)
      Nogawa T
    • Journal Title

      J. Antibiot.

      Volume: (in press)

    • DOI

      doi:10.1038/ja.2012.115

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Spirotoamides A and B, novel 6,6-spiroacetal polyketides isolated from a microbial metabolite fraction library2012

    • Author(s)
      Nogawa T
    • Journal Title

      J. Antibiot.

      Volume: 65 Pages: 123-128

    • DOI

      doi:10.1038/ja.2011.121

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] Construction of a microbial natural product library for chemical biology studies2012

    • Author(s)
      Kato N.
    • Journal Title

      Curr. Opin. Chem. Biol.

      Volume: 16 Pages: 101-108

    • DOI

      DOI10.1016/j.cbpa.2012.02.016

    • Peer Reviewed
  • [Presentation] リベロマイシン生合成におけるサクシニル化機構の解析2013

    • Author(s)
      高橋俊二
    • Organizer
      日本農芸化学会
    • Place of Presentation
      仙台・東北大学
    • Year and Date
      20130324-20130328
  • [Presentation] Secondary metabolite production in Streptomyces can be induced by β-carboline compounds2013

    • Author(s)
      Suresh Panthee
    • Organizer
      日本農芸化学会
    • Place of Presentation
      仙台・東北大学
    • Year and Date
      20130324-20130328
  • [Presentation] 病原性糸状菌Aspergillus fumigatusの第8染色体上の二次代謝遺伝子クラスターに含まれる転写活性化因子の役割2013

    • Author(s)
      加藤 直樹
    • Organizer
      日本農芸化学会
    • Place of Presentation
      仙台・東北大学
    • Year and Date
      20130324-20130328
  • [Presentation] [3,3-D2]heptanoic acid を用いたリベロマイシンD生合成経路の解析2013

    • Author(s)
      宮澤 岳
    • Organizer
      日本農芸化学会
    • Place of Presentation
      仙台・東北大学
    • Year and Date
      20130324-20130328
  • [Presentation] Structure and Function of P450revI in Reveromycin A Biosynthesis2012

    • Author(s)
      高橋俊二
    • Organizer
      チトクロムP450発見50周年記念シンポジウム
    • Place of Presentation
      福岡・九州大学医学部
    • Year and Date
      20121202-20121203
  • [Presentation] 新規リベロマイシン誘導体の創製と活性評価2012

    • Author(s)
      野川 俊彦
    • Organizer
      第54回天然有機化合物討論会
    • Place of Presentation
      東京・東京農業大学
    • Year and Date
      20120918-20120920
  • [Presentation] リベロマイシン生合成における3級水酸基のサクシニル化2012

    • Author(s)
      高橋 俊二
    • Organizer
      第27回 放線菌学会
    • Place of Presentation
      東京・府中の森芸術劇場
    • Year and Date
      20120906-20120907
  • [Presentation] 2-アルキルマロニル-CoA生合成経路の解析2012

    • Author(s)
      宮澤 岳
    • Organizer
      第27回 放線菌学会
    • Place of Presentation
      東京・府中の森芸術劇場
    • Year and Date
      20120906-20120907
  • [Presentation] Identification of small molecules inducing reveromyciji production2012

    • Author(s)
      Suresh Panthee
    • Organizer
      第27回 放線菌学会
    • Place of Presentation
      東京・府中の森芸術劇場
    • Year and Date
      20120906-20120907
  • [Presentation] Novel compound which up-regulates secondary metabolite gene cluster2012

    • Author(s)
      高橋俊二
    • Organizer
      The International Conference of Natural Product Biosynthesis
    • Place of Presentation
      Awaji Yumebutai, Hyogo
    • Year and Date
      20120617-20120622
  • [Presentation] A point mutation in ftmD inactivates the fumitremorgin biosynthetic pathway in Aspergillus fumigates Af2932012

    • Author(s)
      加藤 直樹
    • Organizer
      The International Conference of Natural Product Biosynthesis
    • Place of Presentation
      Awaji Yumebutai, Hyogo
    • Year and Date
      20120617-20120622
  • [Presentation] 化合物アレイ型プラットフォームを用いたcytochrome P450の基質スクリーニング法の開発2012

    • Author(s)
      高山 浩
    • Organizer
      ケミカルバイオロジー学会
    • Place of Presentation
      京都・京都大学
    • Year and Date
      20120607-20120609
  • [Presentation] 放線菌二次代謝産物の生合成2012

    • Author(s)
      高橋 俊二
    • Organizer
      第3回生合成マシナリー札幌セミナー
    • Place of Presentation
      札幌・北海道大学(招待講演)
    • Year and Date
      2012-07-23
  • [Book] 微生物の英知を生かす2012

    • Author(s)
      高橋俊二
    • Total Pages
      1
    • Publisher
      生物工学会誌
  • [Remarks]

    • URL

      http://www.asi.riken.jp/jp/laboratories/departments/cbd/cl-bio/cl-deve/index.html

URL: 

Published: 2014-07-16  

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