核内受容体ＰＰＡＲαを用いた臭素系難燃剤のハイスループットリスク評価

2013 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 24380179
• Research Institution: Shokei Junior College
• Principal Investigator: 石橋 弘志 尚絅大学短期大学部, その他部局等, 准教授 (90403857)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 有薗 幸司 熊本県立大学, 環境共生学部, 教授 (70128148)
• Project Period (FY): 2012-04-01 – 2015-03-31
• Keywords: 核内受容体 / ＰＰＡＲα / 残留性有機汚染物質 / 臭素系難燃剤 / 環境汚染 / 生態系 / リスク評価 / 遺伝子

Research Abstract

昨年度は、脂質代謝などに関与するペルオキシソーム増殖剤応答性受容体 (PPARα) に着目し、これまでにBFRsによるPPARαの転写活性化やそれら活性化能はPFCsと比較して7～17倍強いことを初めて明らかにした。そこで本年度は、時間分解蛍光共鳴エネルギー転移 (TR-FRET)を用いたPPARα-BFRs相互作用のハイスループットスクリーニング法を構築するため、まずPPARα組み換えタンパク質の合成を試みた。
PPARαのリガンド結合領域（LBD）をpEU-E01-GST-N2 vectorあるいはpEU-E01-His-N2 vectorに挿入し、タンパク質発現プラスミドを作製した。次に、ENDEXT® Wheat Germ Expression G/H Kitを用いてin vitro無細胞タンパク質発現系によりGlutathione S-transferase（GST）あるいはHistidine（His）タグ融合核内レセプターLBDタンパク質を発現させ、Glutathione Sepharose 4BあるいはNi Sepharose High Performanceでこれらタグ融合タンパク質を精製した。精製タンパク質はSDS-PAGEで分離後、CBB染色により精製度を確認し、Bioanalyzer (Agilent) でタンパク質濃度を定量した。In vitro無細胞タンパク質発現系により、GSTおよびHisタグ融合PPARα-LBDタンパク質の合成・精製に成功した。
TR-FRETを用いたアッセイ系を構築するため、大量合成・精製したPPARαリガンド結合領域 (LBD)-GST融合組み換えタンパク質をテルビウム標識抗GST抗体で標識し、各濃度の試験物質および蛍光標識トレーサーとの競合反応を行った。得られた用量反応曲線から、PPARα組み換えタンパク質との相互作用に関する試験物質の50%抑制濃度IC50値を算出した。PPARαアゴニストであるGW0742について試験系の構築を行ったところ、良好な用量反応曲線が得られ、IC50値も既報と同程度であった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

これまで臭素系難燃剤によるPPARαの活性化やPPARαを介した生体影響評価に関する研究は皆無であった。本研究により初めて「臭素系難燃剤によるPPARαシグナル伝達撹乱」という新たな毒性作用機序の一端が明らかとなった。また、これまで報告された有機フッ素化合物によるPPARαの活性化能と比較しても、今回見出された臭素系難燃剤によるPPARα活性化能は極めて強いことが明らかとなった。
時間分解蛍光共鳴エネルギー転移 (TR-FRET)を用いたPPARα-BFRs相互作用のハイスループットスクリーニング法の構築についても準備が整ってきた。In vitro無細胞タンパク質発現系により、GSTおよびHisタグ融合PPARα-LBDタンパク質の合成・精製に成功した。また、TR-FRETを用いたアッセイ系を構築するため、大量合成・精製したPPARαリガンド結合領域 (LBD)-GST融合組み換えタンパク質をテルビウム標識抗GST抗体で標識し、各濃度の試験物質および蛍光標識トレーサーとの競合反応を行ったところ、PPARαアゴニストであるGW0742で良好な用量反応曲線が得られ、IC50値も既報と同程度であった。これらのことから、本ハイスループットスクリーニング法により、今後臭素系難燃剤への適用が実施できる。

Strategy for Future Research Activity

他の野生高等動物PPARαの単離･同定をより一層強化し、in vitroレポーター遺伝子アッセイ系の構築や臭素系難燃剤によるPPARα活性化の測定、in vitro無細胞タンパク質発現系によるタンパク質の合成やTR-FRETへの適用など、比較生物学的なPPARαシグナル伝達撹乱を指標としたリスク評価手法を確立する。

Expenditure Plans for the Next FY Research Funding

当初予定していた学会に参加しなかったため。
国際学会等で研究成果を発表する予定である。

Research Products

• [Journal Article] Comparative study of the biological effects of antimicrobials, triclosan and trichlocarban, for C. elegans (2014)
  • Author(s): Inokuchi, A., Nihira, M., Minakoshi, M., Yamamoto, R., Ishibashi, H., Tominaga, N., Arizono, K.
  • Journal Title: Journal of Environment and Safety Volume: 4 Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Effects of lithium on growth, maturation, reproduction, and gene expression in the nematode Caenorhabditis elegans (2014)
  • Author(s): Inokuchi, A., Yamamoto, R., Morita, F., Takumi, S., Matsusaki, H., Ishibashi, H., Tominaga, T., Arizono, K.
  • Journal Title: Journal of Applied Toxicology Volume: 34 Pages: 印刷中
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Quantitative analysis of the interaction of constitutive androstane receptor with chemicals and steroid receptor coactivator 1 using surface plasmon resonance biosensor systems: a case study of the Baikal seal (Pusa sibirica) and the mouse (2013)
  • Author(s): Dau, P. T., Sakai, H., Hirano, M., Ishibashi, H., Tanaka, Y., Kameda, K., Fujino, T., Kim, E. Y., Iwata, H.
  • Journal Title: Toxicological Sciences Volume: 131 Pages: 116-127
  • DOI: 10.1093/toxsci/kfs288
  • Peer Reviewed
• [Journal Article] Study of dietary phytoestrogens and estrogenic activity in pet animal diets (2013)
  • Author(s): Nakashima, S., Ji, H., Ishitobi, S., Kawazoe, S., Koga, M., Shinohara, R., Ishibashi, H., Tominaga, N., Arizono, K.
  • Journal Title: Japanese Journal of Food Chemistry and Safety Volume: 20 Pages: 22-30
  • Peer Reviewed
• [Presentation] PPCPsのエストロゲン様作用のin silicoスクリーニング (2013)
  • Author(s): 瀬原葉子、石橋弘志、石橋康弘、有薗幸司
  • Organizer: 環境ホルモン学会第16回研究発表会
  • Place of Presentation: 東京都文京区
  • Year and Date: 20131212-20131213
• [Presentation] Identification of amino acid residues critical for ligand binding and transactivation in ecdysone receptor (2013)
  • Author(s): Hirano, M., Ishibashi, H., Kim, E. Y., Arizono, K., Iwata, H.
  • Organizer: 環境ホルモン学会第16回研究発表会
  • Place of Presentation: 東京都文京区
  • Year and Date: 20131212-20131213
• [Presentation] In vitro and in silico analyses to predict the effects of environmental chemicals through the mysid ecdysteroid receptor signaling pathway (2013)
  • Author(s): Hirano, M., Ishibashi, H., Kim, E. Y., Arizono, K., Iwata, H.
  • Organizer: The 33rd International Symposium on Halogenated Persistent Organic Pollutants - Dioxin 2013
  • Place of Presentation: Korea
  • Year and Date: 20130825-20130830
• [Presentation] 海産魚類における残留性有機汚染物質の体内分布特性 (2013)
  • Author(s): 石原史隆、小林淳、小森田智大、中島尚哉、伊牟田優希、梅原亮、石橋弘志、有薗幸司、堤裕昭、古賀実
  • Organizer: 第22回環境化学討論会
  • Place of Presentation: 東京都府中市
  • Year and Date: 20130731-20130802
• [Presentation] 有明海の河口域における残留性有機汚染物質の空間分布と分配 (2013)
  • Author(s): 小林淳、小森田智大、中島尚哉、石原史隆、伊牟田優希、梅原亮、石橋弘志、有薗幸司、堤裕昭、古賀実
  • Organizer: 第22回環境化学討論会
  • Place of Presentation: 東京都府中市
  • Year and Date: 20130731-20130802
• [Presentation] 有明海の河口域に棲息する水生生物への残留性有機汚染物質の蓄積解析 (2013)
  • Author(s): 伊牟田優希、小林淳、小森田智大、中島尚哉、石原史隆、梅原亮、石橋弘志、有薗幸司、堤裕昭、古賀実
  • Organizer: 第22回環境化学討論会
  • Place of Presentation: 東京都府中市
  • Year and Date: 20130731-20130802
• [Presentation] Transcriptomic analysis of the liver of Japanese medaka (Oryzias latipes) exposed to Kanechlor-500, BDE47 or PFOS (2013)
  • Author(s): Ishibashi, H., Uchida, M., Hirano, M., Kobayashi, J., Komorita, T., Nakamura, H., Kagami, Y., Kusano, T., Ishibashi, Y., Arizono, K.
  • Organizer: 7th International Conference on Marine Pollution and Ecotoxicology
  • Place of Presentation: Hong Kong
  • Year and Date: 20130617-20130621
• [Book] 健康・栄養科学シリーズ 食べ物と健康 食品の安全（編集 有薗幸司） (2013)
  • Author(s): 石橋弘志、髙本亜希子
  • Total Pages: 249
  • Publisher: 南江堂
• [Book] 健康と環境の科学（川添禎浩 編） (2013)
  • Author(s): 石橋弘志、有薗幸司
  • Total Pages: 166
  • Publisher: 講談社